1 株产γ-氨基丁酸植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

以1 株产γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BC114谷氨酸脱羧酶为研究对象,通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术获得该酶基因,对其进行生物信息学分析,并转入大肠杆菌BL21（DE3）中实现异源表达。采用实时荧光定量PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分别测定重组菌不同发酵时间点谷氨酸脱羧酶基因的表达量、蛋白表达量以及产GABA能力。结果表明：植物乳杆菌中谷氨酸脱羧酶基因大小为1?410?bp,编码469?个氨基酸,蛋白二级结构由α-螺旋（32.2%）、β-折叠（11.5%）和无规则卷曲（56.3%）构成,完成了该酶的三维结构同源建模;成功构建了重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌,谷氨酸脱羧酶基因在诱导6?h相对表达量最大,而蛋白表达量较基因在转录水平表达量有一定滞后,在8?h达最大值,此时GABA产量也达最高,为2?387?mg/L。     

重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成γ-氨基丁酸条件的优化

研究重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的适宜条件。检测温度、p H值、表面活性剂、金属离子、底物与菌体质量比以及反应体系体积对GABA转化效率的影响。结果表明:最优转化条件为:转化体系5 m L、底物L-谷氨酸钠浓度0.1 mol/L、重组大肠杆菌细胞6.4 mg(干质量)、Triton-100体积分数0.06%、Ca2+浓度0.6 mmol/L,转化温度45℃、反应体系p H 4.5。在该体系下反应7 h,GABA合成量达到26.1 g/L,GABA转化效率在1 h时达到最高,为13.8 g/(g h),较优化前提高1.5 倍。     

利用米糠谷氨酸脱羧酶富集γ-氨基丁酸的新研究

通过一系列实验对传统的直接法与"提酶法"富集米糠γ-氨基丁酸(GABA)进行了比较,结果表明提酶法进一步提高了GABA的产率并且成本几乎没有增加."提酶法"即采用米糠谷氨酸脱羧酶(GAD)粗酶液外加谷氨酸钠来富集GABA,产率达到3 789.1 mg/100 g米糠,在此条件下可进一步采用固定化酶的方法固定化GAD粗酶液中的GAD,从而不仅很大程度上提高GAD的利用率,更方便了后期GABA的纯化工作,适合工业化生产要求.     

微生物谷氨酸脱羧酶研究进展

文章综述了谷氨酸脱羧酶的研究概况,包括微生物来源及分布、在微生物中的作用、酶学特性、酶的结构及基因工程,并对其研究前景进行了展望。     

发芽糙米与稻谷的谷氨酸脱羧酶活力及γ-氨基丁酸含量比较

比较了糙米与稻谷发芽期间及培养结束后的静置过程中谷氨酸脱羧酶(GAD)活力、γ-氨基丁酸(GABA)及谷氨酸(Glu)含量变化情况。结果表明,糙米和稻谷在(32±1)℃条件下,以1.2 L/min的通气量,用含有0.1%L-谷氨酸、0.1%抗坏血酸的培养液浸渍发芽,生长速率和呼吸速率均以糙米为快。培养结束时,发芽糙米中GABA含量和Glu含量分别比发芽稻谷增加64.05%和14.68%,空气中放置8 h后发芽糙米中GABA含量比发芽结束时增加了24.32%,整个发芽和静置期间发芽糙米中GAD活力始终高于发芽稻谷。     

产谷氨酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建与食品级表达

谷氨酸脱羧酶(GAD)是生物合成γ-氨基丁酸(GABA)的关键酶。本研究构建了4株无抗标记的重组枯草芽孢杆菌,首次实现了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis IL 1403)来源的谷氨酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的食品级表达。通过比较4株重组枯草芽孢杆菌的生长曲线和发酵酶活曲线,筛选出产酶效率最高的重组菌株B.subtilis WB600/pUB-P43-gadB(opt)-dal,该重组菌在初始发酵培养基中发酵42 h后发酵酶活可达4.1 U/mL。通过调整培养基成分,重组菌B.subtilis WB600/pUB-P43-gadB(opt)-dal的发酵酶活最高达到7.4 U/mL,与初始相比酶活提高了79%,是目前已报道重组枯草芽孢杆菌产谷氨酸脱羧酶酶活的最高水平。     

南瓜谷氨酸脱羧酶酶学特性及γ-氨基丁酸富集条件

对生鲜南瓜(Cucurbita moschata)所含谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)的最适反应温度、最适pH、热稳定性和冷冻稳定性等酶学特性进行研究,并利用其富集γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA),探索了反应时间、南瓜品种、缓冲体系、南瓜及味精添加量、料水比对富集效果的影响。结果表明,南瓜GAD最适反应温度为30~35 ℃,最适pH为5.8。南瓜GAD对热比较敏感,50 ℃保温30 min,酶活力损失20%,70 ℃以上保温30 min可导致酶活力完全丧失。冷冻对GAD影响较小,但长期冷冻仍会导致酶活力损失,冷冻8周酶活力损失36%。GABA最适富集条件为:以pH5.8,0.2 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为反应溶液,南瓜与缓冲液比例为1:3,南瓜添加量25%,味精添加量1.5%,30 ℃反应18 h,反应液中GABA浓度可达7633.2 mg/L,转化率为93.3%,单位质量南瓜GABA富集量为30.5 mg/g,与未富集时相比提高了132倍。     

生物合成γ—氨基丁酸工艺条件的优化

为了建立L-谷氨酸与γ-氨基丁酸（GABA）之间的转化关系,采用二次回归正交旋转组合设计方法对影响GABA生物合成的因素进行优化。建立了GABA生成量与底物浓度、温度、pH之间的数学模型;并确立了GABA制备的最佳工艺条件:底物浓度56.82mmoL/L、温度为40℃、pH为3.53。在此条件下,GABA的生成量达到0.84mg/mL。      

Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403谷氨酸脱羧酶的克隆表达、分离纯化及活性研究

谷氨酸脱羧酶(GAD)是功能因子γ-氨基丁酸(GABA)生物合成过程中的重要酶。为了得到一种有高效活性的GAD基因工程菌,克隆到一种GAD基因,来源于微生物Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403。以pET-22b(+)为载体质粒,Escherichia coli BL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的重组GAD过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白质样品进行SDS-PAGE分析,在约54 000处出现显著的特征蛋白质条带;活性检测结果表明,该重组GAD的转化活性比野生菌株有明显提高,野生菌株经5h细胞转化,反应底物转化率为55.8%,而工程菌20min后转化率达到82.1%,30min后转化可达到98.3%。     

嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶基因及其侧翼区序列分析

从嗜热链球菌Streptococcus thermophilus Y-2的谷氨酸脱羧酶基因(gadB)及其两侧旁邻序列出发,在GenBank中分别用Blastn、Blastx 搜索同源序列。gadB 在核酸水平上无法找到同源序列,在蛋白质水平上与多种细菌的谷氨酸脱羧酶同源。根据谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列构建系统发育树,菌株Y-2 与具核梭杆菌Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953 的亲缘关系最近。gadB 的上游侧翼区与嗜热链球菌LMG 18311 的插入序列IS1216转座酶基因具有很高的相似性。gadB 的下游侧翼区在核酸水平上未找到同源序列,在蛋白质水平上与谷氨酸/γ- 氨基丁酸转运蛋白有很高的相似性。菌株Y-2 的gadB、gadC 排列方式与大肠杆菌、弗氏志贺菌的相同,而与乳酸乳球菌、短小乳杆菌的相反。在已完成全基因组测序的3 个模式株Streptococcus thermophilus LMG 18311、CNRZ1066、LMD-9 中均含有插入序列 IS1216,但未发现谷氨酸脱羧酶基因gadB、谷氨酸/γ- 氨基丁酸转运蛋白基因gadC。     

γ-氨基丁酸的生理功能和研究开发进展

文章对γ-氨基丁酸的生理功能及其研究开发进展进行了综述，并对其研究前景进行了展望。     

谷氨酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的表达及应用

为了研究在枯草芽孢杆菌发酵过程中添加相对廉价的辅酶前体对谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活力和催化效率的影响,将来源于Escherichia coli的谷氨酸脱羧酶基因gadB,通过构建重组质粒p HY300PLK-gadB,在枯草芽孢杆菌中重组表达,得到重组菌B. subtilis/pHY300PLKgadB。研究了分别在重组菌发酵过程中添加辅酶磷酸吡哆醛(PLP)、辅酶前体吡哆醛(PL)和吡哆醇(PN)对GAD酶活力的影响。当设置摇床转速200 r/min,发酵温度33℃,发酵培养基初始p H 7.0时,在发酵过程中分别添加PLP、PL、PN至终浓度0.5 mmol/L,诱导48 h后发酵液中总酶活分别达到25.40、28.14、15.55 U/mL,是对照总酶活的1.55、1.72、0.95倍。基于以上结果,进一步研究了发酵过程中PL的添加浓度对重组菌生长情况及GAD表达的影响。结果表明,发酵液中GAD总酶活随着PL浓度的增加而增加,当PL浓度为0.1 mmol/L时,总酶活最高达到28.28 U/mL。利用重组菌全细胞制备γ-氨基丁酸(GABA),结果表明,最适转化pH为5.0,最适转化温度为40℃,发酵过程中添加PL的重组菌(简称"GAD-PL")和发酵过程中不添加任何辅酶及辅酶前体的重组菌(简称"GAD-0")的最适加菌量(以酶活力单位计)分别是40 U/g(以谷氨酸计)和50 U/g(以谷氨酸计),当谷氨酸最终质量浓度达到400 g/L时,得到的GABA质量浓度分别为275.60 g/L和273.61 g/L。     

谷氨酸脱羧酶活力测定中GABA比色定量方法研究

建立了谷氨酸脱羧酶活力测定中γ-氨基丁酸比色测定方法,该方法灵敏度高、精确性和重现性好。测定程序为:取酶反应液0.4ml,加入Na2CO3(1mol/L)0.1ml、pH10.0硼酸盐缓冲液(0.2mol/L)0.5ml、6%苯酚1ml,混匀,于室温下(20℃)在5min内加入5.2%NaClO溶液1ml,混匀后放置4～8min,然后沸水浴l0min,立即冰浴20min,待溶液出现蓝绿色后,加入2.0ml60%乙醇溶液,混匀后于20℃水浴中放置20～40min,测定640nm处的吸收值。经采用比色法和高效液相色谱法对谷氨酸脱羧酶酶反应液进行测定,两种方法的测定结果相对误差为4.91%。     

发芽糙米γ-氨基丁酸形成的谷氨酸脱羧酶活性与底物变化的相关性分析

以糙米为原料,采用浸泡发芽结合超声波逆境处理方式增加糙米中γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）含量。对发芽过程中谷氨酸（glutamic acid,GA）含量、谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase,GAD）活性及GABA含量进行分析,研究GA含量、GAD活性与GABA含量之间的关系。结果表明：随着发芽时间延长,GABA及GA含量持续明显增加,且GABA与GA含量有显著相关性（P＜0.05）。随着发芽时间延长,GAD活性呈先增后降再增的趋势;在发芽0～48?h之间,对照组GAD活性（以GABA量计）均值为9.25?nmol/g,GABA含量增加到6?倍以上;在48～60?h之间,GABA增量不明显。与对照相比,超声波处理促进GA含量增加2?倍以上,并且快速提高GAD活性,在36?h时发芽糙米中GABA含量最高达41.85?mg/100?g。     

巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶的表达及其酶活性研究

谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)能够催化L-谷氨酸(盐)脱羧反应生成γ-氨基丁酸,它是微生物发酵法生产γ-氨基丁酸的关键酶,具有很高的工业应用价值。本文将来源于巨大芽孢杆菌的谷氨酸脱羧酶(Bm Gad)经克隆至表达载体pET21b后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,并采用亲和层析的方法将该酶纯化后,用比色法测定该酶的酶活性。结果表明,BmGad克隆表达后,采用SDS-PAGE分析可知其相对分子质量约为5.3×10~4 Da。重组蛋白经亲和纯化后,该酶的最适温度为50℃,酶活性达到153U/mg;最适p H为5,酶活性为151 U/mg,在偏中性环境中比较稳定,适合于工业化生产的应用。     

乳酸菌谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究

本文对一株乳酸菌所产谷氨酸脱羧酶的酶学性质进行了较系统的研究,其中包括酶的热稳定性、pH稳定性及温度、pH和一些化学物质对酶活的影响。结果表明:此酶的最适温度为52℃,最适pH为4.5,米氏常数Km=24mmol。PLP、VB6及Ca2 在一定程度上都能促进酶活,且在含量小于100μmol时,作用程度为PLP>VB6>Ca2 。乙酸浓度小于0.05mol/L也能提高酶活力。     

重组谷氨酸脱羧酶的表达条件优化、纯化及酶学性质研究

为了利用从γ-氨基丁酸（GABA）高产菌株——短乳杆菌Lactobacillus brevis CGMCCNO.1306中克隆并表达的谷氨酸脱羧酶进行GABA的生物制备,研究了影响重组工程菌E.coliBL21（pET28α（＋）-gad）生长的培养基组成和攸关GAD表达水平的诱导条件,优化了这些关键因素,提高了重组GAD的表达水平。采用Ni-NTA亲和纯化方法实现了对所得重组GAD的纯化,获得了纯酶,并确定了重组GAD产生GABA的最适pH值和温度,为该酶的工业应用创造了条件。     

植物中γ-氨基丁酸的代谢和功能

γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳非蛋白质氨基酸,存在于大部分真核和原核生物组织中。它在植物体中开启了一个信号传递途径,由于其重要的生理功能而备受重视。GABA的累积主要是受谷氨酸脱羧酶(GAD)的调控,也需要其他酶(GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶)的作用以及胞内和胞外GABA的运输。数据表明,应激条件可引起植物中GABA的积累,因为应激条件可激活信号转换通道,在此通道内,逐渐增加的胞液Ca2+会激活受CaM调控的GAD和进而催化GABA的合成,同时H+也能激活植物中的GAD。生物体中GABA的合成涉及到pH的调节、N的贮藏、植物的生长发育和免疫、兼容性渗透以及谷氨酸盐的选择性利用。本文综述了GABA的代谢途径及代谢中的关键酶,并讨论了GABA在pH调节、储存氮源、植物生长和保护以及谷氨酸的转换利用中的发挥的功能。     

Bacillus methylotrophicus γ-聚谷氨酸合成酶基因的克隆表达

研究了一株非谷氨酸依赖型γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)产生菌Bacillus methylotrophicus SK19.001合成酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达。以p ET-28a(+)载体构建含有pgs BCA合成酶基因的表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21构建重组菌。结果表明,在分别以葡萄糖和谷氨酸为底物的培养基中,重组工程菌都具有合成γ-PGA的能力,说明pgs BCA合成酶基因对于B.methylotrophicus SK19.001产γ-PGA是必需的。pgs BCA合成酶基因序列比对的结果的表明,pgs B和pgs C基因编码的氨基酸序列相对保守。     

发芽绿豆生物转化法富集γ-氨基丁酸

应用高效液相色谱法,以异硫氰酸苯酯为衍生化试剂测定发芽绿豆中γ-氨基丁酸(GABA)的含量,并对发芽绿豆生物转化法富集GABA的各影响因素进行研究。结果表明:发芽绿豆生物转化反应的最适反应温度为40℃,最适pH为6.0。当谷氨酸钠的浓度为4mmol/L时,GABA的生成量最高。Ca2+和维生素B6对GABA都具有激活作用,当Ca2+浓度为1.5mmol/L,维生素B6为1.5mmol/L时,其激活作用最强,分别为未激活时的1.25倍和1.89倍。在该条件下反应2h较合适,由最初的几乎检测不到GABA,到最终能达到796.8mg/100g.干基。由于生物酶转化法生产GABA安全,条件温和,无副反应等原因非常适合应用于食品领域。