荧光假单胞菌GcM5-1A重组鞭毛蛋白的表达及其对黑松细胞的毒性研究

针对松萎蔫病的早期诊断及生物防治,本文利用PCR技术从荧光假单胞菌GcM5-1A的基因组中克隆了鞭毛蛋白编码基因fliC,再将该基因克隆到表达载体pET-15b的NcoI和XhoI位点,构建重组质粒pET-15b-fliC,再将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3),构建工程菌,IPTG诱导工程菌高效表达C-末端具有多聚组氨酸标签的重组鞭毛蛋白,重组蛋白主要以包涵体的形式存在,包涵体经8mol/L尿素溶解,复性并经Ni2+螯合柱亲和层析得到了电泳纯的重组鞭毛蛋白。生测结果表明,重组鞭毛蛋白可引起黑松细胞的大量死亡,与天然鞭毛蛋白对黑松愈伤组织细胞有相似的毒性。该研究为松萎蔫病致病机理的研究奠定了基础。     

表达荧光假单胞菌鞭毛蛋白工程菌的构建及其对黑松的毒性

构建了组成分泌表达载体pUC18ompA,将荧光假单胞菌Pf-5鞭毛蛋白的编码基因fliC克隆到pUC18ompA构建pUC18ompA-fliC,重组质粒转化E.coliBL21(DE3)构建了工程菌。工程菌与无菌松材线虫混合接种黑松无菌苗,研究其对无菌苗的致病能力。接种试验结果表明,工程菌与无菌松材线虫混合接种同样可以引起黑松无菌苗的萎蔫。进一步验证了体内荧光假单胞菌鞭毛蛋白在松材线虫病致病过程中的作用。     

松材线虫纤维素酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术克隆了松材线虫纤维素酶的编码基因BXC46,克隆基因与已报道的纤维素酶基因BXC10（GenBank登录号：FJ598020.1）的同源性高达99%,将其克隆到表达载体pET-15b上构建了表达载体pET-15b-BXC。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株构建工程菌,SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导了纤维素酶在工程菌中表达。采用Ni2＋-NTA树脂亲和层析部分纯化了重组松材线虫纤维素酶,DNS法进行的活性测定表明,部分纯化的重组蛋白具有纤维素酶的活性,其最适温度为45℃,最适pH为4.0。     

杀松材线虫海洋真菌ML-5的鉴定及培养条件研究

针对危害松属植物的重要病原物松材线虫,本文对采自青岛附近海域的样品进行真菌分离,采用浸渍法对分离得到的35株真菌的培养滤液进行杀线活性测定,从中筛选得到了1株具有高杀松材线虫活性的真菌ML-5,用其培养滤液处理松材线虫72h时,线虫的校正死亡率可达86.51%。通过形态学观察和18SrDNA序列分析,将其鉴定为青霉属(Penicillium)的一种真菌。对ML-5的培养条件进行了研究,确定菌株ML-5在PD培养基中杀线活性最佳的培养条件是:100%海水浓度,初始pH值5.0~6.0,培养温度25℃,培养时间7d。该研究为海洋真菌活性物质的开发及在松萎蔫病防治方面的应用提供了理论依据。     

人参β-AS基因RNAi表达载体工程菌的构建

利用重组PCR和酶切连接技术构建了人参β-香树素合成酶(β-AS)基因RNAi(RNAinterference,RNAi)植物表达载体,再经热转化法转化到发根农杆菌A4菌株中,得到含有人参β-AS基因RNAi植物表达载体的工程菌,为诱导转化人参外植体奠定了基础。     

人防御素HNP-1在大肠杆菌中的融合表达及可溶性研究

根据大肠杆菌密码子偏爱性用PCR方法分别获得人防御素HNP-1基因序列,利用SOE技术和不含信号肽的DsbA基因片段拼接后将产物克隆到质粒pET-11b中构建人防御素HNP-1与分子伴侣DsbA的融合表达载体,转化E.coliJM109,提取阳性克隆进行测序后抽取质粒转化表达宿主E.coliBL21（DE3）.工程菌经IPTG诱导后可在胞内以可溶形式大量表达DsbA-HNP-1蛋白.重组蛋白经亲和层析法纯化后达到电泳纯,经体外复性,在抗菌试验中表现出对短小杆菌的抗菌活性.     

重组精氨酸脱亚胺酶的制备工艺

研究了重组精氨酸脱亚胺酶(r ADIES)的30 L规模发酵、制备工艺及其生物学活性。将构建好的工程菌先进行摇瓶活化获得种子液,转入30 L发酵罐进行培养,用IPTG进行诱导表达;表达产物进行高压匀浆破菌、包涵体洗涤、溶解稀释复性后经DEAE阴离子交换层析柱和Butyl疏水层析柱纯化;通过SDS-PAGE和RP-HPLC等方法检测表达和纯度;用体外测活法检测活性。将工程菌进行放大培养并诱导表达,获得了相对分子质量在46 k Da的r ADIES。重组蛋白表达量占总蛋白的25%以上,经制备工艺获得的r ADIES纯度高于95%,酶活性为42IU。实验结果表明:该工艺具有可行性,可以获得较高活性的重组精氨酸脱亚胺酶。     

绿色荧光蛋白标记在MEOR中的应用研究

为了充分认识目的优势菌种经油藏运移后在产出水中分布的规律与数量,准确分析和客观评价MEOR现场试验效果,利用绿色荧光蛋白(GFP)基因标记目的菌,通过绿色荧光蛋白跟踪监测目的菌的动态信息。构建含有GFP基因的质粒pET-30a(+)-EGFP,并将其成功导入JD中。对构建的JD(gfp)工程菌进行培养发现,该工程菌在含有Kan质量浓度50μg/mL的培养条件下,重组质粒在JD(gfp)工程菌体内传代稳定,绿色荧光的表达稳定。但是在没有选择压力的培养条件下,重组质粒在JD工程菌胞体内有丢失现象。与野生菌混合培养,JD(gfp)工程菌具有很好的配伍性和竞争性,并且不发生重组质粒的水平转移,因此在环境中释放是安全的。     

中国明对虾溶菌酶点突变基因的原核表达

为解决中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)溶菌酶成熟肽(FcLys)可溶性问题,构建了点突变基因的原核表达质粒,并进行重组表达。以已构建的带有FcLys目的基因的重组克隆质粒为模板扩增FcLys点突变(FcLysM)的基因片段,将该对虾溶菌酶成熟肽序列的N端和C端中含有几个疏水性氨基酸经点突变改为亲水性氨基酸,但不改变其活性中心和二硫键的形成。将FcLysM的基因片段与表达载体连接并转化,制得基因工程菌pET-39b(+)-FcLysM/Rosetta(DE3)。通过基因测序方法验证该重组表达质粒读码框的准确性以及FcLysM目的基因序列的正确性。该工程菌表达后在SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子质量约为43ku的融合蛋白FcLysM。进一步研究分析证明,该重组点突变蛋白的可溶性表达量高于非突变的对虾溶菌酶表达量。     

杀线虫海洋细菌G-23的鉴定及培养条件研究

针对危害松属植物的重要病原物松材线虫,本文对采自于青岛近海海域的样品进行细菌分离,得到49株细菌,并采用浸渍法对这些菌株的培养液进行杀线虫活性测定,从中筛选出1株具有较高杀线活性的海洋细菌G-23,将该菌株鉴定为产黑假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens),对菌株G-23的培养条件及所产杀线虫活性物质的稳定性进行研究,结果表明,该菌株产杀线活性物质的最佳培养条件为:初始pH8.0,培养温度25℃,菌龄19h,培养时间3d;在海水浓度为100%的Zobell 2216E培养基中生长,有利于活性物质的产生;该菌株产生的杀线虫物质热稳定性较好,既有极性小的物质,也有水溶性物质,在弱碱性(pH8.0)条件下活性较稳定。该研究可为海洋微生物活性物质的开发利用以及松萎蔫病的生物防治提供了理论依据。     

Lrrcl0蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET～Lrrcl0和Lrrcl0蛋白表达,利用NcoI和BamHI双酶切载体pMDl8-T-Lrrcl0,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a（＋）,转入E．colistrainDH5d．茵落PCR筛选阳性茵落,提取阳性茵质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E．colistrainB121（DE3）,于37℃振荡培养,用1mmol／LIPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrcl0。转入E．colistrainBL21（DE3）进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrcl0;Lrrcl0蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

噬夏孢欧文氏菌GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶相互作用的研究

GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶是噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成代谢中的两个关键酶。本研究将编码GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶的基因crtE和crtB共转化大肠杆菌或将crtE、crtB及编码八氢番茄红素脱氢酶的crtI共转化大肠杆菌,IPTG诱导其表达,然后利用亲和层析、凝胶过滤层析纯化重组蛋白。Western blotting分析结合N-末端序列分析表明,GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶以两种复合体的形式存在,而八氢番茄红素脱氢酶则不能与这两种酶形成稳定的复合体。     

重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中的表达与纯化

从嗜热菌Thermus aquaticus中分离出的Taq DNA聚合酶由于其热稳定性，在聚合酶链式反应(PCR)中得到广泛的应用，我们根据编码Taq DNA聚合酶的基因序列，设计出一对引物，通过PCR扩增出Taq DNA聚合酶基因，并将其克隆到表达载体pET-15b中，转化大肠杆菌E．coli BL21(DE3)，经IPTG诱导后，重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中实现了大量表达。经过热变性、亲和层析、阳离子交换层析获得了电泳纯的重组Taq DNA聚合酶。本研究的生产程序可作为Taq DNA聚合酶生产的一种新方法。     

重组海参溶菌酶基因工程菌的构建及原核表达

根据GenBank中海刺参溶菌酶的cDNA序列(Accession no.EF036468),利用RT-PCR技术扩增出海刺参溶菌酶的基因片段(SL),将其克隆到原核表达载体pET-32a(+),得到重组质粒pET-32a(+)-SL,再转化至E.coil Rosetta(DE3)pLysS。利用IPTG诱导表达,重组蛋白经SDS-PAGE分析,得到一条分子质量约为31ku的特异条带。经过Western blotting分析鉴定,结果显示重组海参溶菌酶成功在大肠杆菌中表达,并且有部分可溶性蛋白,占总菌体蛋白约10%。这些结果为进一步研究海参溶菌酶的作用机理奠定基础。     

β-琼脂糖酶（AgaA7）在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

为研究重组β-琼脂糖酶（AgaA7）基因的表达产物及其酶学性质,根据GeneBank中β-琼脂糖酶（AgaA7）基因的编码序列合成此基因后,将其克隆到表达载体pET-22b（＋）中,并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达.纯化后的表达产物经SDS-PAGE检测其相对分子质量并测定其酶学性质.结果表明：重组酶的相对分子质量为～5.0×10^4,与预期相符.此酶最适反应pH是7.0,在pH58的缓冲液中最稳定;最适反应温度为50℃,在低于50℃时比较稳定.Na^＋,K^＋,Ca^2＋,Mg^2＋对重组酶活性影响不大,而Zn^2＋,Hg^2＋,Pb^2＋则对酶活性具有不可逆抑制作用.     

一株微生物采油菌的16S rDNA鉴定和绿色荧光蛋白分子标记

筛选到一株高效生产多糖的YX菌,油田先导试验证明该菌可以用于微生物调剖提高原油采收率（Microbial Enhanced Oil Recovery,MEOR）.经16SrDNA分析鉴定,YX菌属于肠内杆菌属（Enterobacter.）,为跟踪监测其动态信息,构建表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的重组质粒pET-30a（＋）-EGFP,利用CaCl2法将其转化至YX菌,利用荧光显微镜可以观察到重组YX（GFP）工程菌的绿色荧光.结果表明YX菌可以被绿色荧光蛋白基因标记,用于微生物采油研究.     

阻燃木材的燃烧特性分析（二）

根据木材阻燃机理,以磷-氮体系阻燃剂为主进行复配,获得3组配方（质量比）：三聚氰胺∶磷酸∶硼酸=2∶2∶3;聚磷酸铵∶双氰胺=2∶1;尿素∶双氰胺∶磷酸=1∶3∶4。每组配方分别配制浓度为5%,10%,15%的阻燃液,采用浸渍法在恒温80℃下,浸渍24 h处理白杨木材试样。利用锥形量热仪在热辐射功率为50 kW/m2的条件下,对阻燃处理后的木材试样以及空白试样进行燃烧特性分析。实验结果表明,三聚氰胺、磷酸、硼酸组成的配方在增强木材试样的耐火性、抑制试样产烟量和一氧化碳生成率方面效果显著;聚磷酸铵APP、双氰胺组成的配方在控制木材试样燃烧速度和降低总热释放量方面效果显著;尿素、双氰胺、磷酸组成的配方在提高载药量、降低热释放速率、延长点燃时间、抑制二氧化碳生成率方面效果显著;3组配方在降低木材试样的质量损失率和有效燃烧热方面效果相近。综合各项分析结果,确定尿素、双氰胺、磷酸按1∶3∶4的比例（质量比）配制浓度为15%的阻燃液为最佳配方。