细交链孢菌酮酸人工抗原的制备

对链格孢霉菌毒素中危害最大的细交链孢菌酮酸进行设计和修饰,系统研究载体、蛋白和偶联方法与条件,结合人工抗原纯化、鉴定的结果,分析影响免疫原合成的各种因素,确定碳二亚胺法偶联细交链孢菌酮酸与牛血清白蛋白可获得偶联比为9.7∶1的人工抗原,能够满足动物免疫需求。     

光照对交链孢毒素合成的调控

目的 明确光调控交链孢（Alternaria）产真菌毒素的作用。方法 在光/暗培养条件下,比较分析光照对2种交链孢菌株（ATCC 66981和Pear-3）的菌丝生长、孢子形成以及毒素合成的影响。结果 持续白光照射对交链孢菌丝生长影响不显著,而显著抑制其孢子形成。光照刺激交链孢菌ATCC 66981中交链孢酚（alternariol, AOH）、交链孢酚单甲醚（alternariol monomethyl ether, AME）和腾毒素（tentoxin, TEN）3种毒素的产生。菌株持续光照培养30天,AOH、AME和TEN毒素浓度分别为120、182和173 g/L;较之黑暗培养,分别增加了1.1、5.9和9.6倍。光照抑制交链孢菌Pear-3中细交链孢菌酮酸（tenuazonic acid, TeA）毒素的合成。菌株光照培养6天,TeA毒素浓度即已达142 g/L;而黑暗培养甚至高达325 g/L,毒素产率反而增加了1.3倍。结论 光照不影响交链孢菌丝生长,而对孢子形成影响显著;持续白光照射能够促进交链孢中AOH、AME和TEN毒素的产生,而抑制TeA毒素的产生。     

臭氧处理对交链孢菌生长及其毒素积累的抑制作用

交链孢菌（Alternaria spp.）易侵染农作物,引起农产品病害,而且能够代谢产生交链孢毒素,包括细交链孢酮酸（tenuazonic acid,TeA）、交链孢酚（alternariol,AOH）、交链孢酚单甲醚（alternariol monomethyl ether,AME）等,严重影响人体健康。因此,亟需高效、安全的方法用以防控交链孢菌及其毒素积累。本实验研究了臭氧处理对体外互隔交链孢（A. alternata）生长及其产毒能力的影响。结果表明,臭氧处理组的菌落直径显著低于对照组（P＜0.05）,且臭氧处理可显著抑制互隔交链孢产生TeA、AOH、AME这3 种交链孢毒素;利用扫描电子显微镜观察臭氧处理后互隔交链孢的微观形态,发现孢子和菌丝发生了凹陷、褶皱、断裂等异常现象;臭氧处理后的交链孢菌对番茄果实的致病力明显减弱,同时交链孢菌的产毒能力明显降低,20 mg/L臭氧处理条件下TeA、AOH、AME含量比对照组分别减少了36.1%、89.9%、93.2%。此外,臭氧对TeA、AOH、AME具有降解作用,降解率随着臭氧质量浓度的增加和处理时间的延长而显著提高,TeA经过20 mg/L臭氧处理30 min即可被完全降解,AOH及AME经20 mg/L臭氧处理120 min后降解率可达90%以上。综上,臭氧处理可以作为农产品及其制品中互隔交链孢及其毒素污染的防治手段。     

番茄交链孢菌病斑及其外延组织中交链孢毒素的分布

目的 检测不同大小的交链孢菌病斑及其外延组织中交链孢毒素残留量, 明确交链孢毒素在番茄中的迁移规律。方法 样品经80%乙腈溶液提取后, 通过自制固相萃取柱排除杂质干扰, 流出液经氮吹至近干后, 采用超高效液相色谱-串联质谱仪(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)测定交链孢毒素残留量。结果 不同大小病斑组织中均检测到高浓度的4种交链孢毒素残留, 包括交链孢酚(alternariol, AOH), 交链孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether, AME), 细交链格孢酮酸(tenuazonic acid, TeA)和交链孢烯(altenuene, ALT); 外延组织中仅在病斑周围1 cm处检测到TeA, 含量为病斑组织的1/10左右。结论 番茄交链孢毒素能向病斑外延组织扩散, 但扩散情况与病斑大小无直接联系, 病斑周围2 cm处虽然用超高效液相色谱-串联质谱仪检测不到交链孢毒素, 但仍存在安全风险, 因此, 建议食用时或生产中将病斑及其外延2 cm范围内组织均剔除。     

胶束电动毛细管色谱法分析3种交链孢毒素主成分含量

目的 建立胶束电动毛细管色谱法(micellar electrokinetic chromatographic, MEKC)测定3种交链孢毒素[交链孢酚(alternariol, AOH)、交链孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether, AME)和交链孢菌酮酸(tenuazonic acid, TeA)]主成分含量的新分析方法。方法 以未涂层熔融石英毛细管柱(50μm×30 cm, 20 cm, i.d.)为分离柱,分别以3种分离缓冲溶液[40 mmol/L Na_2B_4O_7-120 mmol/L十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)(含体积分数为5%的乙腈)、30mmol/LNa_2B_4O_7-40mmol/LSDS(含体积分数为30%的异丙醇)和60mmol/L Na_2B_4O_7-180 mmol/L脱氧胆酸钠]及2种样品缓冲溶液[8 mmol/L硼砂(含体积分数为57%的甲醇用于AOH和TeA)、8mmol/L硼砂(含体积分数为57%的异丙醇用于AME)]分析AOH、AME和TeA的主成分含量。结果 AOH、AME、TeA的方法精密度分别为0.05%、0.01%和0.21%(n=5),检出限分别为5、15和0.5 mg/L。主成分含量分别为99.94%、99.78%和97.28%,且与高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)的结果无显著差异(α=0.05)。结论 MEKC法可作为HPLC法测定3种交链孢毒素主成分含量方法的互补方法 ,能够满足3种交链孢菌毒素主成分含量分析的要求。     

基于光谱法研究异细交链孢菌酮酸半抗原-抗体的相互作用

本文采用紫外可见光谱(UV-Vis)、荧光光谱和圆二色谱(CD)技术研究了异细交链孢菌酮酸单克隆抗体(Mc Ab)与其半抗原(Ite AH)之间的相互作用并用ELISA方法对荧光结果进行了验证。结果表明,ITe AH对Mc Ab有荧光猝灭作用,淬灭机理主要为静态猝灭且遵循非辐射能量转移理论。在298、310、318 K 3个温度下,ITe AH与Mc Ab的结合常数分别为1.9×106、1.6×106、1.4×106 L/mo L,结合位点数n≈1,结合距离r为3.35 nm,经ELISA测得的结合常数与荧光分析的结果较一致。由结合作用过程的热力学参数可知,两者之间以静电引力为主要作用力,不同p H下,由ELISA结果可推测其影响了ITe AH与抗体结合。同步荧光光谱显示ITe AH的加入并未使抗体的酪氨酸和色氨酸残基附近的微环境发生明显改变,两者的结合位点更倾向于酪氨酸残基,圆二色谱分析发现ITe AH与Mc Ab相互作用后,抗体的二级结构发生明显变化。     

农产品及其制品中交链孢酚和交链孢酚单甲醚研究进展

交链孢菌(Alternaria spp.)是一类重要的植物病原体,能产生多种毒素,其中交链孢酚(alternariol,AOH)和交链孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether,AME)是目前从食物中检出的比较普遍和主要的2种交链孢毒素,可广泛污染蔬菜、水果及谷物等农产品及其制品。本文对AOH和AME的结构及理化性质、毒性、产生影响因素、生物及化学合成和污染现状等进行了综述,并对交链孢毒素限量标准的制定、快速检测方法等进行了展望。     

小麦粉中细交链孢菌酮酸和腾毒素标准物质的研制

目的 研制小麦粉中细交链孢菌酮酸和腾毒素标准物质.方法 利用天然污染交链孢霉毒素的小麦样籽粒制备,按照规定的定值程序,形成符合国家相关要求的小麦粉中细交链孢菌酮酸和腾毒素标准物质.结果 研制成功2个不同浓度水平的小麦粉中细交链孢菌酮酸和腾毒素标准物质,并获批国家二级标准物质[标准号:GBW(E)100547和GBW(E...     

番茄中交链孢菌及其产毒的防治技术研究进展

交链孢属真菌是导致番茄采后病害的主要病原菌,腐烂的番茄不仅造成巨大的经济损失,而且会在其腐烂部位及其周围健康组织中积累大量的真菌毒素。目前加工工艺的限制导致番茄制品也可能受到真菌毒素的污染,进而对人类和动物健康造成潜在的威胁(包括致癌、致畸、致突变等作用)。因此,本文综述了国内外番茄及其制品中交链孢毒素的污染情况,以及交链孢菌及其毒素污染防治技术的研究进展,以期为降低番茄及其制品的风险隐患提供参考。     

间接竞争化学发光酶联免疫分析法检测番茄酱和果汁中异细交链孢菌酮酸

针对番茄酱和果汁中链格孢霉菌毒素污染问题,建立异细交链孢菌酮酸(iso-tenuazonic acid,ITe A)间接竞争化学发光酶联免疫分析法。通过棋盘法和单因素试验确定最佳包被原质量浓度为15.6 ng/m L、抗体质量浓度为稀释96 000倍、缓冲体系pH 7.4、竞争反应时间和二抗反应时间分别为40 min和50 min。方法IC50为2.13 ng/m L,线性范围为0.50~9.12 ng/m L,检测限为0.10 ng/m L,与结构功能类似物交叉反应率均小于0.1%,样品添加回收率在78.60%~110.83%之间,变异系数均小于15%。本方法适用于样品中ITe A污染的特异性快速筛查。     

纳他霉素对葡萄采后交链孢菌的抑制作用

交链孢菌(Alternaria sp.)是导致鲜食葡萄采后腐烂变质的主要病原菌。以葡萄采后交链孢菌为病原菌,采用生长速率法、悬滴法及活体接种法,研究了不同浓度纳他霉素抑菌液对菌丝生长、孢子萌发的抑制作用以及对果实的防病效果。结果表明,适宜浓度的纳他霉素对葡萄采后交链孢菌的抑制效果明显,对菌丝生长及孢子萌发的抑菌中浓度(EC50)分别为83.48和89.47mg/L;当抑菌液浓度达200mg/L时,对菌丝生长和孢子萌发的抑制率均达到80%以上。活体接种实验结果表明,浓度为200mg/L的纳他霉素抑菌液可显著(p<0.05)抑制葡萄采后交链孢菌引起的霉烂变质。综上,纳他霉素处理对葡萄采后交链孢菌具有较好的抑制活性,可作为葡萄采后绿色保鲜剂的潜在资源。     

纳他霉素对葡萄采后交链孢菌的抑制作用

交链孢菌(Alternaria sp.)是导致鲜食葡萄采后腐烂变质的主要病原菌。以葡萄采后交链孢菌为病原菌,采用生长速率法、悬滴法及活体接种法,研究了不同浓度纳他霉素抑菌液对菌丝生长、孢子萌发的抑制作用以及对果实的防病效果。结果表明,适宜浓度的纳他霉素对葡萄采后交链孢菌的抑制效果明显,对菌丝生长及孢子萌发的抑菌中浓度(EC50)分别为83.48和89.47mg/L;当抑菌液浓度达200mg/L时,对菌丝生长和孢子萌发的抑制率均达到80%以上。活体接种实验结果表明,浓度为200mg/L的纳他霉素抑菌液可显著(p<0.05)抑制葡萄采后交链孢菌引起的霉烂变质。综上,纳他霉素处理对葡萄采后交链孢菌具有较好的抑制活性,可作为葡萄采后绿色保鲜剂的潜在资源。      

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸的研究进展

链格孢霉（Alternaria）是污染食品和饲料最普遍的真菌之一。细交链格孢菌酮酸（tenuazonic acid,TeA）是链格孢霉毒素中最为重要的一种,可广泛污染蔬菜、水果及谷物。本文综述TeA毒素的来源及污染情况、理化性质及其毒性、检测方法等,并就未来研究方向进行展望。     

高效液相色谱法快速检测小麦中交链孢酚单甲醚

开发了一种高效检测小麦中交链孢酚单甲醚(alternariolmethyl ether,AME)的高效液相色谱(HPLC)检测方法。将样品采用乙腈/甲醇/水(45/10/45,体积比),30℃振荡提取30min后,经Bond Elut Plexa固相萃取小柱净化后,上样检测,检测器采用紫外检测器。该方法AME检测限为2.52μg/kg,定量限为8.40μg/kg,线性范围为0.25～2.00μg/mL,加标样品中不同浓度的AME回收率为80.1%～88.3%,日内精密度和日间精密度分别为2.13%～6.59%和3.57%～8.43%。     

电子束辐照降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究

采用高能射线电子束辐照处理脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）,并采用高效液相色谱法进行DON含量测定,以研究不同辐照剂量对DON溶液中毒素的降解效果和不同浓度DON溶液对辐照降解率的影响。研究结果表明：高效液相色谱法可以很好地对DON进行检测,高能射线电子束对DON溶液降解效果显著,辐照剂量增大,降解率增大。在相同的辐照剂量下,1～10 kGy时,DON溶液浓度越大,降解率越大;10～20 kGy时,浓度越小,降解率越大。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定麦芯粉中四种交链孢毒素

探讨固相萃取方法,超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MS/MS)测定麦芯粉中4种交链孢毒素。样品经0.05 mol/L Na H2PO4(pH 3.0)-乙腈-甲醇超声提取(450+450+100,V/V),上清液过HLB固相萃取柱净化,以1.0 mmol/L氨水溶液(pH 8.3)-甲醇为流动相,经Waters CORTECS C18(4.6×100 mm,2.7μm)柱分离梯度洗脱,采用电喷雾负离子(ESI-)、多反应监测(MRM)模式检测;以基质加标工作曲线定量。细交链孢菌酮酸(TeA)、交链孢酚(AOH)在2.0μg/L~100μg/L浓度范围内,腾毒素(TEN)、交链孢酚单甲醚(AME)在0.2μg/L~10.0μg/L浓度范围内线性关系良好,相关系数(R2)均大于0.998。回收率为76.3%~107.5%,TeA、AOH检出限和定量限分别为1.0μg/kg和3.0μg/kg、TEN、AME检出限和定量限分别为0.1μg/kg和0.3μg/kg。该方法灵敏度高,简便,准确。适于测定麦芯粉中的交链孢毒素。     

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定粮食中4种交链孢霉毒素

为同步测定大米、玉米和小麦中4种交链孢霉毒素,本研究建立了相应的超高效液相色谱-串联质谱法。试样中交链孢霉毒素用酸化乙腈水溶液提取,经HLB固相萃取柱净化后,以ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7μm, 2.1 mm×100 mm)为分析柱,以0.55 mmol/L氨水水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱,以负离子电喷雾模式电离(ESI^-),多反应离子监测(MRM)方式进行定性和定量检测,外标法定量。在本方法条件下,4种交链孢霉毒素在3种基质中线性范围内均呈现良好的线性关系(R²>0.990 0),方法检出限0.4～4.0μg/kg,定量限1.0～10.0μg/kg。在3种加标水平下,4种毒素的回收率范围为62.50%～113.40%,相对标准偏差RSD≤7.89%。采用建立的方法检测了市售大米和小麦中的4种交链孢霉毒素,大米中4种毒素的污染水平为ND～12.18μg/kg,小麦中为ND～163.32μg/kg,本方法可满足实际样品的检测。     

QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定小麦粉中4种交链孢霉菌素

目的建立QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定小麦粉中4种交链孢霉菌素含量。方法样品以丙酮为提取剂,经QuEChERS法前处理,采用Endeavorsil C_(18)色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8μm),以甲醇-1.5 mmol/L碳酸氢铵为流动相,梯度洗脱,多反应监测模式检测,细交链孢菌酮酸含量采用内标法定量,交链孢酚、腾毒素和交链孢酚单甲醚含量采用外标法定量。结果该方法对4种交链孢霉菌素有很好的分离效果,检出限为0.06~0.50μg/kg,回收率为85.4%~104.3%,相对标准偏差为2.3%~9.8%,相关系数≥0.9990。结论本方法简便、快速,灵敏度、精密度、回收率均满足方法学要求,适用于小麦粉中4种交链孢霉菌素含量的同时测定。     

鼠李糖乳杆菌对互隔交链孢的抑制作用研究

目的:筛选对互隔交链孢具有良好拮抗作用的乳酸菌菌株。方法:采用菌饼法筛选乳酸菌优良菌株。采用酸性实验和热处理实验分析拮抗特性,利用气相测定乳酸菌无细胞上清液（CFS）中有机酸的含量,扫描电镜分析细胞结构完整性。结果:从4株乳酸菌中筛选出1株对互隔交链孢具有较强抑制作用的鼠李糖乳杆菌RH-11,抑菌率为93.41%。在p H3.0⁷.0时具有抑菌活性,抑菌物质对热不稳定。经气相色谱分析RH-11 CFS中乳酸、乙酸和苯乳酸含量分别为109.225μg/m L、7.334μg/m L和3.712μg/m L,对互隔交链孢抑制作用的贡献率分别为68.90%、20.03%和11.07%。扫描电镜结果表明RH-11 CFS处理互隔交链孢孢子的细胞膜完整性被破坏。结论:鼠李糖乳杆菌RH-11抑制互隔交链孢的物质主要为乳酸、乙酸和苯乳酸,抑制作用是破坏了孢子的完整性。      

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原的合成及其多克隆抗体制备

本研究采用肟化法用羧甲基羟胺半盐酸盐对链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸(Tenuaconic acid,TA)进行衍生后引入连接臂,得到了半抗原TAO。通过活性酯法将半抗原TAO分别与牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)偶联制备得到免疫原TAO-BSA、与血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)偶联制备得到包被原TAO-KLH。经透析纯化后分别采用紫外光谱、红外光谱扫描法对合成的人工抗原进行初步鉴定,制备得到的人工抗原的偶联比分别为18.3:1、38.7:1。此人工抗原免疫Balb/c小鼠后获得的鼠源抗血清进一步验证了人工抗原合成成功,制备得到特异性识别TA的多克隆抗体。通过ELISA棋盘法确定了最佳包被原浓度以及最佳抗体稀释度并建立了TA间接竞争ELISA检测方法,其灵敏度以半抑制浓度IC50表示为335.55 ng/m L,最低检出限(LOD)为19.00 ng/m L,定量线性检测范围为200.00~1563.00 ng/m L。