环境因子对阪崎克罗诺肠杆菌生物膜形成的研究

目的研究阪崎克罗诺肠杆菌生物膜的形成特性。方法采用结晶紫染色法检测生物膜形成量,考察培养时间、培养温度以及初始pH值3个环境因子对阪崎克罗诺肠杆菌生物膜形成的影响。结果结果表明培养时间、培养温度以及初始pH值对生物膜形成影响较大,且各阪崎克罗诺肠杆菌的最佳成膜条件分别为:阪崎克罗诺肠杆菌CICC21550最适温度为30℃,最适PH为7,最佳培养时间为36h;阪崎克罗诺肠杆菌CICC 21562最适温度为30℃,最适pH为5,最佳培养时间为48 h;阪崎克罗诺肠杆菌CICC 21544最适温度为42℃,最适pH为7,最佳培养时间为24 h;阪崎克罗诺肠杆菌CICC 21563最适温度为30℃,最适pH为7,最佳培养时间为36 h。结论 4株阪崎克罗诺肠杆菌的生物被膜成膜能力由强及弱依次为阪崎克罗诺肠杆菌CICC 21550、21544、21563、21562。本研究为阪崎克罗诺肠杆菌生物膜相关研究提供理论参考。     

不同培养基质上阪崎克罗诺杆菌生物膜的比较

为了比较阪崎克罗诺杆菌在玻璃、聚丙烯及不锈钢表面形成的生物膜,将培养48 h的阪崎克罗诺杆菌生物膜经荧光染料SYTO 9/PI标记后,用激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)联合COMSTAT软件定性定量地分析生物膜结构。结果表明:阪崎克罗诺杆菌在3种材料表面形成的生物膜的总生物量、平均厚度及平均扩散距离依次是不锈钢聚丙烯玻璃,粗糙系数及表面积与生物量比值则为不锈钢聚丙烯玻璃,生物膜的菌体活死比例是玻璃高于聚丙烯、不锈钢。另外,标准菌株ATCC 29544生物膜的总生物量、菌体活死比例、平均厚度及平均扩散距离均高于分离株Ⅰ、Ⅱ,粗糙系数及表面积与生物量比值均低于分离株。可见,阪崎克罗诺杆菌在不锈钢表面的成膜性强于玻璃与聚丙烯,标准菌株ATCC 29544的成膜能力高于2株食品分离菌株。     

不同条件对阪崎克罗诺肠杆菌生物被膜形成的影响

本研究旨在探究不同生长温度(12℃、25℃、37℃)、培养基质(胰蛋白胨大豆肉汤、婴幼儿乳粉肉汤)和接触材料(不锈钢、玻璃、硅胶)对阪崎克罗诺肠杆菌ATCC 29004生物被膜形成的影响。研究首先通过活菌计数法评估不同条件下阪崎克罗诺肠杆菌粘附及生物被膜中的活菌量反映菌体粘附及成膜能力;随后借助场发射扫描电镜观测不同因素对菌体生物被膜微观结构的影响;最后分析不同条件下形成的生物被膜对三种季胺类消毒剂的抗性。结果表明:25℃和37℃下阪崎克罗诺肠杆菌的粘附菌量和生物被膜形成量高于12℃,菌体在胰蛋白胨大豆肉汤中的生物被膜形成量高于在婴幼儿乳粉肉汤中的形成量,37℃时硅胶材料表面粘附菌量高于不锈钢和玻璃材料,其他条件下菌体在三种材料表面粘附和生物被膜形成量无明显差异;阪崎克罗诺肠杆菌在25℃和37℃形成了致密且立体的生物被膜结构,12℃生物被膜为单层结构,三种材料表面生物被膜结构呈现出明显差异;阪崎克罗诺肠杆菌生物被膜对消毒剂的抗性取决于菌体的生长温度、接触材料及消毒剂的种类。综上所述,生长温度、培养基质和接触材料对阪崎克罗诺肠杆菌生物被膜形成均有影响,调节生长条件和选择接触材料对于控制阪崎克罗诺肠杆菌生物被膜的形成具有重要意义。     

盐酸小檗碱对体外阪崎克罗诺杆菌生物膜的抑制作用

阪崎克罗诺杆菌是食源性条件致病菌,它能够在食品生产环境以及设备表面形成生物膜,从而成为食品的潜在污染源。本研究探讨了盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌生物膜的抑制作用,旨在从中药来源中寻找可以控制阪崎克罗诺杆菌生物膜的抗菌物质。采用XTT法评价了盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌粘附能力及其生物膜形成的影响。盐酸小檗碱对阪崎克罗诺杆菌的抑制效果表现出了剂量依赖性,MIC_(90)值为512μg/m L。浓度为1 024μg/m L的盐酸小檗碱能够通过降低阪崎克罗诺杆菌的粘附能力从而显著抑制生物膜的形成,并且可以部分清除阪崎克罗诺杆菌成熟的生物膜。因此,盐酸小檗碱对于预防控制阪崎克罗诺杆菌生物膜的形成以及由生物膜导致的临床感染具有潜在的应用价值。     

硅胶表面阪崎克罗诺杆菌生物膜的形态观察

阪崎克罗诺杆菌是一种食源性条件致病菌,它能导致婴幼儿罹患坏死性小肠结肠炎、菌血症、脑膜炎等疾病。在硅胶表面形成生物膜,可能是导致阪崎克罗诺杆菌感染的重要途径。使用结晶紫法测定阪崎克罗诺杆菌ATCC BAA-894在食品级硅胶表面的静态生物膜成熟曲线,并且采用扫描电子显微镜对其在食品级硅胶表面的静态生物膜的形成过程进行形态学观察。观察到阪崎克罗诺杆菌在硅胶表面形成了具有三维结构的成熟生物膜形态。在3 h能粘附到硅胶表面,并且在12 h~24 h已经形成了比较成熟的生物膜。     

检测阪崎肠杆菌间接ELISA方法的建立

建立阪崎肠杆菌(Enterobacter Sakazakii,ES)特异性抗体间接ELISA检测方法,以期作为融合后杂交瘤细胞株的筛选体系。应用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,筛选最佳反应条件,建立检测该病原菌的酶联免疫吸附检测方法。通过对ELISA反应条件优化,确定菌体抗原包被的最适工作浓度为2×105mL-1,4℃包被过夜;5%脱脂奶粉进行封闭;血清最佳稀释比为1∶2 000;酶标抗体最适稀释度为1∶1 000倍;最后确定37℃显色10 min,检测灵敏度达到103mL-1。该方法的建立为阪崎肠杆菌单克隆抗体制备过程中阳性杂交瘤细胞株的筛选提供有效手段和奠定实验基础。     

免疫磁性壳聚糖微球的制备及对阪崎肠杆菌的分离效果

目的:制备用于特异性分离阪崎肠杆菌的免疫磁性壳聚糖微球以及对阪崎肠杆菌的捕获效果。方法:采用反向悬浮交联法制备磁性壳聚糖微球,并对微球的表面进行氨基化修饰,然后与阪崎肠杆菌多克隆抗体进行偶联,制备免疫磁性壳聚糖微球。优化磁性壳聚糖微球对阪崎肠杆菌多克隆抗体的偶联条件,包括偶联时间、磁性壳聚糖微球用量、偶联体系p H,对抗体的饱和偶联量。通过与显色培养基结合的方法研究免疫磁性壳聚糖微球对阪崎肠杆菌的捕获能力。结果:制备的磁性壳聚糖微球通过表面修饰能连接上大量的活性氨基,在p H 7.4的偶联体系中,10.0 min即可完成对阪崎肠杆菌多克隆抗体的偶联,0.01 g磁性壳聚糖微球对抗体的饱和偶联量为25~50μL。当阪崎肠杆菌浓度较低时,制备的免疫磁性壳聚糖微球对阪崎肠杆菌的捕获率达94.7%,对阪崎肠杆菌的灵敏度为5 cfu/m L。结论:获得阪崎肠杆菌免疫磁性壳聚糖微球,该微球是一种非常有潜力的快速富集、分离阪崎肠杆菌的有效方法。     

反式肉桂醛与温和加热结合对复原婴幼儿牛乳中阪崎克罗诺肠杆菌的抑杀作用

研究反式肉桂醛与温和加热结合对复原婴幼儿牛乳中阪崎克罗诺肠杆菌的抑杀作用。将3 种阪崎克罗诺 肠杆菌的混合菌株（浓度约6.6（lg（CFU/mL）））接种于含有不同质量分数反式肉桂醛（0、0.1%、0.2%、0.3% 和0.4%）的复原婴幼儿牛乳样品中,将样品置于25、45、50、55 ℃培养,并在不同的时间点对样品中存活的阪崎 克罗诺肠杆菌涂布计数。为探究反式肉桂醛与温和加热结合的抑杀机制,实验利用LIVE/DEAD?细菌活性检测试 剂盒和场发射扫描电子显微镜探究细胞膜完整性及细胞形态。结果表明：0.4%的反式肉桂醛在25 ℃处理90 min、 45 ℃处理20 min、50 ℃处理10 min及55 ℃处理10 min使复原婴幼儿牛乳中阪崎克罗诺肠杆菌总数降低至检出限 以下。与反式肉桂醛及温和加热单独作用相比,反式肉桂醛结合温和加热对阪崎克罗诺肠杆菌有显著的抑杀效果 （P＜0.05）,并且随温和加热温度的升高及反式肉桂醛质量分数的增加,效果更加明显。温和加热与反式肉桂醛 结合会影响细胞膜的通透性并使细胞破碎瓦解。以上结果表明：反式肉桂醛与温和加热结合有潜力在冲调乳粉过程 中应用,从而降低阪崎克罗诺肠杆菌的感染风险。     

阪崎肠杆菌的生物学特性及其在婴幼儿配方奶粉中的预测模型

研究阪崎肠杆菌的生长特性,考察不同温度、NaCl含量、pH值条件下阪崎肠杆菌在脑-心浸萃液态培养基中的生长情况。为建立婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的生长模型,将阪崎肠杆菌接种到婴幼儿配方奶粉中,用4个一级生长模型结合美国农业部东部地区研究中心开发的IPMP2013软件,拟合阪崎肠杆菌在37℃的生长情况。结果表明:阪崎肠杆菌的最适生长条件:温度35~40℃,NaCl含量1%~3%,pH 5~8。温度、NaCl含量、pH值对阪崎肠杆菌存在显著性影响。Huang模型比Baranyi模型、Gompertz模型和Three-Phase Linear模型更适合拟合婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌生长曲线。     

柳江县市售国产婴幼儿配方粉中阪崎肠杆菌污染监测分析

目的 了解市售国产婴幼儿配方粉中阪崎肠杆菌污染状况,为消费预警提供科学依据。方法 分别按2011、2012年版国家食源性致病菌监测工作手册对市场上11家国内生产的32份婴幼儿配方粉进行检测。结果 32份样品检出2株阪崎肠杆菌,检出率为6.25%。其中婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌检出率4.35%(1/23);婴幼儿谷物食品中阪崎肠杆菌检出率11.11%(1/9)。结论 柳江县市售部分婴幼儿配方粉中存在阪崎肠杆菌污染,食用安全隐患不容忽视,应加强监测力度,预防和控制阪崎肠杆菌引起的食物中毒事件发生。     

基于多壁碳纳米管/SDBS/硫堇阪崎肠杆菌免疫传感器的研究

目的:研制一种灵敏度高、电化学性能稳定的免疫传感器,构建准确检测阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii,E.sakazakii)的电化学方法。方法:将硫堇(Thi)、辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体(HRP-anti-E.sakazakii)依次自组装固定于多壁碳纳米管(MWCNT)/十二烷基苯磺酸钠(SDBS)修饰的四通道丝网印刷电极上,制得一次性免疫传感器。采用原子力显微镜(AFM)表征电极修饰和孵育抗原后的表面形态,用循环伏安法(CV)考察不同修饰电极的电化学特性,根据还原峰电流的变化对阪崎肠杆菌进行测定。结果:在优化的实验条件下,该方法检测阪崎肠杆菌的线性范围为102～108cfu/mL,检测限为5.7×101cfu/mL(S/N=3)。结论:该免疫传感器灵敏度很高,具有较好的特异性、重现性(RSD=6.3%)、稳定性(4℃无菌容器中放置15d后电流响应为初始值的93.24%)和准确性(与GB/T4789.40-2010符合率为96.67%),具有一定的应用潜力。     

IgG-Biotin-Avidin-HRP信号转导探针结合免疫比色法快速检测克罗诺阪崎肠杆菌

本文建立了一种快速检测克罗诺阪崎肠杆菌的新型免疫比色法。用抗体修饰的磁球(MNPs-IgG)作为捕获探针分离、富集克罗诺阪崎肠杆菌,再通过免疫夹心法分别结合生物素标记的克罗诺阪崎肠杆菌抗体(Biotin-IgG)和亲和素标记的辣根过氧化物酶(Avidin-HRP),形成的复合物与底物四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine,TMB)发生显色反应,经硫酸终止后,有色产物的吸光度值与克罗诺阪崎肠杆菌浓度的对数有良好的线性关系,在103～107CFU/mL范围内,线性方程为y=0.2353x-0.2307。本研究成功设计优化了基于比色法的克罗诺阪崎肠杆菌定量检测新方法,检测限为8.68×10~2CFU/mL(S/N=3),加标样品检出率96%,检测时间不超过2.5 h,为实际应用与商品化提供了理论支撑。     

1 株宽宿主谱的阪崎肠杆菌噬菌体生物特性分析及其在乳制品中的应用

以阪崎肠杆菌菌株ATCC25944为宿主菌从河涌水中分离1 株噬菌体TBC-1,具有较宽的阪崎肠杆菌宿主范围。电镜形态学及生物特性结果显示：此噬菌体衣壳为二十面体,具有可收缩性尾部;该噬菌体的最佳感染复数（multiplicity of infection,MOI）为0.001,一步生长曲线显示其潜伏期20 min,爆发期50 min;爆发量为100 PFU/cell;该噬菌体在温度区间40～50 ℃及pH 4～10之间可以保持其效价稳定;对阪崎肠杆菌有较好的裂解杀菌效果,并且MOI越高抑制效果越好。全基因组测序分析显示：该噬菌体的基因组为双链DNA,全基因组分子质量85 313 bp,平均GC含量40.65%,共有118 个蛋白编码区,24 个tRNA。应用结果显示,TBC-1对牛乳中2 种阪崎肠杆菌的抑制效果：室温（25 ℃）培育3 h ,在MOI为106时,能将102 CFU/mL菌抑制到检出限以下;TBC-1对乳粉中2 种阪崎肠杆菌的抑制效果：在25 ℃与37 ℃培育3 h,ATCCBAA894菌量均减少到检出限以下,在25 ℃培育3～12 h,ATCC25944菌量均在检出限以下。本研究表明噬菌体TBC-1具有宽宿主谱系特性、稳定的裂解杀菌以及在牛乳与乳粉中对不同的阪崎肠杆菌均有良好的抑制作用,有潜力成为阪崎肠杆菌生物抑制剂。     

环介导等温扩增法快速检测阪崎肠杆菌

目的：研究阪崎肠杆菌的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP)方法,实现对食品中阪崎肠杆菌的快速检测。方法：针对阪崎肠杆菌16S rRNA 基因(16S rDNA)及外膜蛋白A(OmpA)基因设计LAMP 引物,扩增后通过电泳或加入显色剂SYBR-GREEN Ⅰ检测。结果：LAMP 法能有效特异地检测出阪崎肠杆菌;以16S rRNA 引物检测阪崎肠杆菌的最低检出限为32CFU/mL,用OmpA 引物检测阪崎肠杆菌的最低检出限达3CFU/mL,扩增产物加入SYBR-GREEN Ⅰ在紫外条件下可见荧光,与电泳检测具有同样的灵敏度。结论：LAMP 法可实现对阪崎肠杆菌的快速检测,在食品检测中具有广阔的应用前景。     

基于PAMAM树枝状大分子纳米免疫传感器快速检验婴幼儿奶粉中的阪崎肠杆菌

以聚酰胺胺树状大分子材料结合还原性石墨烯纳米复合物为电活性修饰膜层,固定于玻碳电极表面,采用物理吸附法固定化辣根过氧化物酶标记阪崎肠杆菌抗体制备成纳米免疫传感器,建立一种快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的方法。优化的试验条件:以K3[Fe(CN)_6]为探针,过氧化氢浓度为0.5 mmol/L,pH 7.0的PBS溶液为检测底液,孵育温度37℃、孵育时间20 min。采用微分脉冲伏安法研究免疫传感器响应电流与阪崎肠杆菌浓度之间的关系。结果表明,免疫响应电流与阪崎肠杆菌浓度之间呈线性关系(ΔIpc(μA)=-1.1817 lg C+1.723,R~2=0.9989),其检出限为5.8×10~1 CFU/mL(S/N=3)。该法用于检测婴幼儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌,其结果与国标方法(实时荧光PCR法)的数据一致,而且具有样品预处理简单、灵敏度高、快速、费用低等优点,可用于婴幼儿食品中阪崎肠杆菌的快速检测。     

中国安徽阜阳劣质婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的污染

2004年中国安徽阜阳劣质婴儿配方粉事件引起了我国政府的高度重视.为了调查婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的污染状况,根据美国FDA和加拿大实验室的方法,建立了婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的分离鉴定技术.从87份阜阳劣质奶粉样品中检测到11份阪崎肠杆菌阳性样品,污染阳性率为12.6%.用API 20E和Qualicon BAX(R)系统鉴定了11株阪崎肠杆菌.这是国内首次从婴儿配方粉中分离到阪崎肠杆菌菌株.     

冰激凌中阪崎肠杆菌的检测

目的 对市售冰激凌中的阪崎肠杆菌进行抽样检测。方法 按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 (GB 4789.40- 2010)》进行检验。结果 从冰激凌中检出阪崎肠杆菌,经过染色和生化试验, 在29份样品中有3份样品分离出阪崎肠杆菌,检出率为10.34%。结论 市售冰激凌样品中存在一定比例的阪崎肠杆菌,有较大的安全隐患。质检系统应加强对市售的冰激凌的卫生预防与控制。     

原儿茶醛对阪崎克罗诺肠杆菌毒力因子的抑制作用

探究植物源活性物质原儿茶醛对阪崎克罗诺肠杆菌泳动运动能力、生物被膜形成能力、黏附和侵入Caco-2细胞能力及9 种与菌体相关毒力基因转录的影响。结果表明,原儿茶醛对6 株阪崎克罗诺肠杆菌实验菌株的最小抑菌质量浓度（minimal inhibitory concentrations,MIC）和最小杀菌质量浓度均为2 mg/mL,对阪崎肠杆菌ATCC29544亚抑制浓度分别为1/200、1/100 MIC和1/50 MIC。亚抑制浓度的原儿茶醛能够抑制阪崎克罗诺肠杆菌在琼脂软平板中泳动运动能力;减弱菌体在12 ℃和25 ℃下不同时间段（24、48、72 h）生物被膜的形成能力;降低细菌黏附及侵入Caco-2细胞能力;下调9 种与菌体相关毒力基因的转录量。研究结果表明原儿茶醛能够抑制阪崎克罗诺肠杆菌多种毒力因子,其有潜力作为抗生素补充剂或抗毒性物质预防及控制阪崎克罗诺肠杆菌引起的相关感染。     

LAMP法检测乳粉中的阪崎肠杆菌

据WHO最新报告显示,乳粉中的阪崎肠杆菌是导致婴幼儿感染和死亡的主要原因之一。FDA于2002年公布了婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌检测的推荐方法,但检测周期长达1周左右,而且操作复杂,难以满足控制该疾病暴发和传播的需要。DNA环介导等恒扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种特异性、灵敏度高、检测时间短的新型基因扩增技术。本文以阪崎肠杆菌为研究对象,建立了一套应用于婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌快速检测方法。针对阪崎肠杆菌16s RNA基因设计4条引物特异性识别靶基因的六个特殊区域,并在63℃进行恒温扩增。实验结果表明,使用该方法能够在5h之内检测出复原乳样品中101CFU/mL的阪崎肠杆菌。灵敏度可以达到100fg阪崎肠杆菌基因组DNA。应用环介导等温扩增法,克服了传统检测周期长、操作复杂的缺点,不仅能够用于婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的检测,而且满足了对于婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌快速检测的迫切需要。     

百里醌对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用

为探究百里醌对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用及可能的抑制机理,检测了百里醌对阪崎克罗诺肠杆菌的最 小抑菌浓度（minimal inhibitory concentrations,MIC）及对其生长动力学模型的影响,并测定百里醌处理后阪崎肠 杆菌胞内ATP浓度、胞内pH值、膜电位、细胞膜完整性的变化,最后利用场发射扫描电子显微镜观察细胞形态的 改变。结果表明：百里醌对阪崎克罗诺肠杆菌的MIC为0.3～0.6 mg/mL;百里醌使阪崎克罗诺肠杆菌的生长迟滞期 延长,最大生长速率减小;百里醌影响了阪崎克罗诺肠杆菌细胞膜的通透性,表现为：质量浓度为MIC和2×MIC 的百里醌使细胞内ATP浓度由6.52 μmol/L分别降低为0.27 μmol/L和0.17 μmol/L,胞内pH值分别由5.69降低为5.22和 4.99,细胞膜完整菌体比例分别降低至80%和22%,引起细胞膜膜电位超极化;场发射扫描电子显微镜观测表明百 里醌使阪崎克罗诺肠杆菌细胞膜褶皱,菌体干瘪。综上所述,百里醌是通过影响细胞膜通透性和改变细胞形态抑制 阪崎克罗诺肠杆菌。这些结果表明百里醌有潜力作为控制阪崎克罗诺肠杆菌的天然抑菌剂应用于食品中。