微生物发酵对豆粕抗原性的影响

探讨了微生物发酵对豆粕抗原性的影响。选用植物乳杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和米曲霉这5种菌株,在液态和固态条件下分别发酵豆粕12 h,对发酵产物进行抗原性测定。结果表明:豆粕经这5种菌株发酵后,粗蛋白含量均有所提高,其中枯草芽孢杆菌在固态发酵时降解豆粕抗原蛋白和降低豆粕抗原性的效果优于其它菌株,此时,豆粕蛋白水解度为4.89%,必需氨基酸含量为193.51mg/g。SDS-PAGE显示发酵豆粕中β-伴大豆球蛋白的α’和α亚基消失,β亚基条带和大豆球蛋白的酸性亚基条带密度减弱,同时大豆球蛋白与β-伴大豆球蛋白的抗原性降低率分别为20.62%和50.12%。     

几株米曲霉成曲胞外蛋白鉴定及发酵结果分析

采用SDS-PAGE电泳和MALDI-TOF-MS技术,鉴定4株米曲霉成曲胞外蛋白表达量最高的4种蛋白,其中2种确定为淀粉酶和碱性蛋白酶,这2种酶在4株米曲霉成曲胞外蛋白中的表达量和都超过胞外蛋白总量的50%,但不同菌株间淀粉酶与碱性蛋白酶表达量比例不同。同时分析蛋白电泳凝胶酶蛋白表达量、酶活与发酵结果的关系,结果表明酶蛋白表达量与酶活力具有较好的一致性。蛋白酶活力低的菌株发酵氨基酸态氮水平并不低,淀粉酶高的菌株发酵生成还原糖较低。     

哈茨木霉酸性蛋白酶基因的克隆表达及其水解应用

为了对哈茨木霉酸性蛋白酶（Acid Protease,Ap）的性质研究,采用RT-PCR克隆了哈茨木霉Ap基因,转化至毕赤酵母GS115菌株中获得高效表达,然后对该重组蛋白酶（Recombinant Acid Protease,rAp）的酶学性质和水解大豆分离蛋白的效果进行测定。结果表明,重组毕赤酵母在500 mL三角瓶中诱导表达时,发酵液中rAp酶活力达到21.50 U/mL。该rAp为天冬氨酸蛋白酶,最适温度为55 ℃,在40 ℃处理120 min仍具有较强的热稳定性;最适pH值为2.50,在不同pH缓冲液中处理24 h后,pH值2.00~5.00具有较强稳定性。Cu2+、Ni2+和Mn2+能显著促进活性,相对酶活分别高达116.21%、113.79%和117.44%;而Fe2+、Fe3+、0.50% SDS和5.00% Trion X-100显著抑制活性,其相对酶活分别78.02%、79.26%、2.6%和13.19%。rAp和胃蛋白酶对大豆分离蛋白水解后,水解产物中蛋白相对含量分别为14.67%和3.64%,β-伴大豆球蛋白抗原性分别降低了30.01%和26.10%,球蛋白抗原性分别降低了22.37%和15.63%。从以上结果可知,rAp对大豆分离蛋白具有较强水解和降低抗原性的能力,具有潜在的应用开发价值。     

多菌混合固态发酵豆粕的工艺研究

研究多菌混合固态发酵豆粕的工艺条件,以可溶性蛋白质和大豆球蛋白含量为评价指标,设计发酵时间、发酵温度、初始水分、含糖量、外源酶的添加量以及中、酸性蛋白酶不同比例等六个因素,进行单因素和正交试验,单因素试验得出:含糖量为2%,中、酸性蛋白酶比例为3∶1;正交试验得出:发酵时间为7d、发酵温度40℃,初始水分为40%、外源酶添加量为0.45%,该条件下可溶性蛋白质的含量为165.8μmol/g,大豆球蛋白的含量为11.4μmol/g,豆粕发酵效果较为理想。     

高产蛋白酶菌株等离子体诱变及其在提高豆粕发酵效果中的应用

采用常压室温等离子体(ARTP)技术对Bacillus amyloliquefaciens 10160进行诱变处理。以致死率达到80%作为ARTP诱变(诱变时间为10 s)的最佳剂量,筛选得到了C5和C12两株遗传稳定的诱变菌株.。与初始菌株相比,诱变菌株的中性蛋白酶酶活分别提高了86.0%和85.0%。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示,C5、C12以及初始菌株提取的蛋白的组成无明显的差异,然而诱变样品的蛋白浓度明显高于初始菌株。通过豆粕液态发酵发现,与初始菌株相比,菌株C5发酵后的多肽得率和含量分别提高了14.2%和15.6%;菌株C12发酵后的多肽得率和含量分别提高了13.2%和11.8%。诱变后发酵液中中性蛋白酶的酶活也大大提高,菌株C5和C12发酵后中性蛋白酶酶活分别增加了26.0%和29.8%。多肽分子量分布和ACE抑制率无显著差异。可见,ARTP处理Bacillus amyloliquefaciens 10160可以显著提高其豆粕液态发酵制备降血压肽的产率。     

白曲酸性蛋白酶在无孢黑曲SH-2中的克隆表达及酶学性质分析

白曲霉酸性蛋白酶在白酒酿造发酵过程中具有溶解发酵原料的颗粒,促进微生物繁殖,分解蛋白质生成香味物质,降解酵母菌体蛋白等多种功能,可以提高白酒风味,因此被广泛应用于白酒生产中。本研究利用经基因工程改造的低内源蛋白背景的黑曲霉宿主SH-2,表达白曲霉酸性蛋白酶基因pepB。通过PCR技术获得pepB以及表达元件糖化酶启动子PglaA、糖化酶终止子TglaA、乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶标记基因pyrG,在pMD18-T载体基础上,构建了pepB表达载体,通过PEG介导转化法转化无孢黑曲酶SH-2。重组菌株经发酵罐发酵240 h,发酵粗酶液酶活达9722 U/mL,是报道的白曲原始菌株酶活的8.5倍,SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为47 ku。酶学性质分析结果表明,该酸性蛋白酶最适反应温度为35℃,最适pH为4.0,Mn~(2+)、Cu~(2+)对酶活有显著地激活作用。最后,探究了在不同发酵初始pH下重组菌株酶活的变化,结果显示,在pH 4.5~6.5范围内,适当提高发酵初始pH,酸性蛋白酶酶活会提高。以上结果表明,本研究成功构建了一株能胞内高效表达白曲酸性蛋白酶的菌株。     

大豆酶解蛋白复合酶组合试验研究

将非淀粉多糖酶、蛋白酶进行优化组合,酶解处理豆粕,能将大豆中大分子蛋白质降解成小分子肽,同时消除抗营养因子,以提高蛋白质消化吸收利用率。试验采用两次正交试验设计和单因素试验,结果表明,优化组合非淀粉多糖酶形成非淀粉多糖复合酶,酶解处理豆粕,处理后豆粕中非淀粉多糖去除率达到24.91%;优化中性蛋白酶,酶解处理豆粕,处理后豆粕中肽的质量分数达到18.34%,大豆球蛋白去除率达到97.61%,β-伴大豆球蛋白去除率达到96.60%;经非淀粉多糖复合酶、中性蛋白酶复合处理豆粕后得到大豆酶解蛋白:粗蛋白质49.15%、酸溶蛋白28.32%、肽质量分数18.49%、非淀粉多糖11.74%、大豆球蛋白3.40 mg/g、β-伴大豆球蛋白4.90 mg/g、棉籽糖1.00 mg/g、水苏糖3.20 mg/g、脲酶活性0.01 U/g、粗灰分6.44%、钙0.44%、水分8.10%。     

发酵低温豆粕生产碱性蛋白酶的工艺研究

以提油后的副产物——低温豆粕为培养基的主要成分,利用枯草芽孢杆菌为发酵剂发酵产酶,以碱性蛋白酶活力为考察指标,通过响应面法对培养基和发酵条件进行了优化。结果显示在发酵条件一定的前提下,当培养基组成为1.48%葡萄糖、0.57%豆粕、0.05%KH2PO4时,碱性蛋白酶有最高酶活1792±47.72294u/mL;以此为培养基,对发酵初始pH、温度、接种量三个条件进行优化,发现当pH8.9,接种量为4.9%,35.4℃时碱性蛋白酶活最高。此条件下进行三次平行实验,酶活为2401u/mL,比未优化前提高了37%,从而以低成本的原料,得到较高的经济效益。     

产蛋白酶耐酸细菌的筛选鉴定及混菌固态发酵豆粕的初步试验

为筛选出与乳酸菌混合发酵豆粕效果较佳的菌株,以透明圈法分别从霉豆腐、发酵豆粕、酱油发酵原液等样品中初筛得到13株产蛋白酶菌株,经过复筛固态发酵豆粕酶活、小肽、水解度的测定和耐酸性实验,最终得到1株耐酸性较好且蛋白酶活力较高菌株A-12,经形态观察、生理生化实验和分子生物学实验,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。利用此菌株与实验室保藏的植物乳杆菌NCU116混合发酵,结果表明,发酵后豆粕中胰蛋白酶抑制因子降解量为98.8%,营养物质如粗蛋白和小肽的含量分别提高了11.04%和13.71%,而且豆粕具有酸香味儿,适口性得到改善;枯草芽孢杆菌A-12可以做为与乳酸菌混和发酵豆粕的1株参考菌株。     

产蛋白酶兼性厌氧菌株的筛选、酶学性质及发酵豆粕应用探究

为筛选得到1 株或几株深层发酵豆粕效果较好的菌株,以透明圈法从自然发酵的豆豉中筛选出4 株兼性厌氧且产蛋白酶菌株,同时发现菌株B-1、B-12在厌氧条件下产蛋白酶能力好于好氧条件,对此现象较明显且平板水解圈直径较大的菌株B-1进行形态学、生理生化和分子生物学实验,鉴定为甲基营养型芽孢杆菌。进一步对菌株B-1的蛋白酶酶学性质进行研究后发现,酶活力在pH 6.0～9.0的范围内能够维持一个较高的水平,酶反应和酶稳定最适条件为pH 7.0和40 ℃,加入Mn2+对酶反应的促进作用较大。将甲基营养型芽孢杆菌B-1以6%的接种量接种于豆粕固态发酵培养基中堆积（20 cm）发酵,以枯草芽孢杆菌A-12好氧浅层发酵和未发酵豆粕作为对照,发酵结束后测得豆粕中小肽含量和水解度分别高达28.37%和29.55%,比枯草芽孢杆菌固态发酵对照组分别高出了9.04%和16.07%,与未发酵豆粕相比,菌株B-1发酵后豆粕的小肽含量和水解度也分别提高了27.22%和29.13%。     

酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因反义干扰及对乙醇发酵的影响

通过构建酿酒酵母沉默表达载体PURH-ADH2,使ADH2基因在PGK强启动子、CYC1终止子在特定区域内进行干扰和表达。采用Bam HI和Xmal I限制性内切酶对SADH2基因和PURH质粒进行双酶切,构建反义重组表达质粒PURH-SADH2,通过高效酵母转化法和电转法将重组质粒组件转化至酿酒酵母SY01细胞中,获得阳性克隆菌株JY01。酿酒酵母JY01突变菌株与出发菌株SY01和Y01发酵试验结果相比,JY01甘油脱氢酶酶活比出发菌株Y01与SY01分别下降了16.31%和13.5%;当酿酒酵母Y01、SY01和JY01菌株发酵36~60 h时,JY01菌株甘油含量相比Y01分别下降了16.34%、14.25%、14.89%;当酿酒酵母突变菌株发酵48 h时,Y01、SY01和JY01的乙醇浓度分别为6.243 g/100 m L、7.145 g/100 m L和7.288 g/100 m L,酿酒酵母JY01发酵液乙醇量比比原始菌株Y01乙醇含量提高了14.33%。结果表明通过反义干扰ADH2基因5’UTR序列,能有效干扰酵母工程菌株ADH2转录与表达,削弱甘油积累途径,促进乙醇代谢途径。     

米曲霉固态发酵豆粕生产大豆肽

采用米曲霉A-9005固态发酵豆粕,研究所产蛋白酶的活力。结果表明其较优工艺为：发酵原料中豆粕含量为87%,初始pH值6.4,发酵温度为33℃,发酵时间为102 h,测得蛋白酶活为1 789.47 U/g。试验为米曲霉固态发酵豆粕产大豆肽的研究提供了相应的工艺参数和一定的理论依据。     

混菌株固态发酵高温豆粕工艺优化

选出最佳的菌种组合黑曲霉、酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌后,调整混合菌种比例为2∶2∶1∶1,菌株进行固态发酵高温豆粕的最佳工艺条件:接种量10%,料水比1∶3,发酵时间96 h,发酵温度33℃,p H7.0,Mg SO4·7H2O 0.04 g,Ca Cl20.02 g,KH2PO40.04 g。粗蛋白含量为54.22%,比原料豆粕中的增加了24.36%。抗原蛋白7S球蛋白亚基和11S酸性亚基大部分被混合菌株分泌的酶系降解为分子质量更小的蛋白亚基;氨基酸含量由发酵前的41.53%提高到的48.18%;胰蛋白酶抑制剂(TI)含量由发酵前的16.91 mg/g降到0.20 mg/g,粗蛋白和氨基酸含量大幅度提高,抗原蛋白大部分被降解,TI含量显著降低,营养价值得到了很大改善,且发酵产物有豆香味、黄褐色。     

高产高纯度果胶甲酯酶黑曲霉工程菌的构建

为获得一株高产高纯度的果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌,提高果胶甲酯酶的产量,从果胶酶生产菌种中克隆了果胶甲酯酶基因pmeA,通过同源重组的原理,冻融法转化农杆菌、农杆菌介导法转化黑曲霉方法,成功构建了分泌表达果胶甲酯酶的纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）。基本发酵培养基中发酵第9 d上清中最高酶活达到467.77 U/mL。进一步敲除重组菌株TH-2（glaA::pmeA）中背景蛋白酸稳定的α-淀粉酶的编码基因asaA,获得纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA?pyrG?asaA）。该菌株在添加1%的硫酸铵的发酵培养基中培养7 d后,发酵液上清中主要的背景蛋白均消失。但是与纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）相比,果胶甲酯酶表达量有所下降,最高酶活为255.40 U/mL。重组果胶甲酯酶的最适作用温度为50 ℃,适合的温度范围是40~80 ℃,在80 ℃下仍能维持其酶活性的70%以上,适合的pH范围是3.0~5.0,最适pH为4.0。最终获得了一株温度和pH作用范围较宽的高产高纯度果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌。     

降解豆粕菌株的筛选及发酵工艺优化

利用产蛋白酶能力较强的菌株将脱脂豆粕原料中的大豆蛋白降解为大豆多肽.以蛋白酶活力及水解度为指标筛选出降解豆粕能力较强菌株W-13,并以水解度为指标对菌株发酵降解豆粕的条件进行了优化,得到最适发酵条件为:11%豆粕、2%玉米粉、3%接种量、发酵时间48 h,在最适培养基上蛋白水解度为65%.     

发酵豆粕分泌蛋白酶的兼性厌氧型菌株筛选与鉴定

在厌氧条件下筛选固态发酵豆粕的生产菌株。以透明圈法分别对中外发酵豆粕、霉豆腐、酱油发酵原液等进行厌氧条件下高产大豆蛋白酶生产菌株进行筛选。利用初筛得到的单菌在厌氧条件下发酵豆粕,以小肽含量和蛋白酶酶活力为指标进行复筛,得到优势菌株NCU646。结果表明：厌氧条件下NCU646菌株在豆粕固态发酵培养基中产蛋白酶活力高达9600U/g,发酵后豆粕中小肽含量提高10倍以上,豆粕中粗蛋白含量增加了近10.0%。经过生理生化鉴定和16S rRNA基因序列分析鉴定,该菌株为兼性厌氧型的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。     

不同预处理对低温脱脂豆粕中大豆β-伴球蛋白功能性质的影响 关键词：

采用新鲜低温脱脂豆粕、干热处理脱脂豆粕和溶剂浸提脱脂豆粕为原料制备大豆β-伴球蛋白,研究预处理对低温脱脂豆粕残余脂质含量和脂肪氧合酶酶活以及制备大豆β-伴球蛋白功能性质的影响。干热处理对低温脱脂豆粕中残余脂质含量无显著影响,但可使得脂肪氧合酶酶活下降7.69%;溶剂浸提使得低温脱脂豆粕中残余脂质含量和脂肪氧合酶酶活分别下降98.08%和96.12%,表明溶剂浸提可显著抑制低温脱脂豆粕中脂质过氧化反应的发生。干热处理低温脱脂豆粕使得制备大豆β-伴球蛋白溶解性、持水性、持油性、乳化性、起泡性以及凝胶性质变差,溶剂浸提低温脱脂豆粕可改善制备大豆β-伴球蛋白溶解性、持水性、持油性、乳化性、起泡性和凝胶性质。这一研究结果为改善大豆蛋白功能性质提供前期研究基础。     

碱性蛋白酶对β-伴大豆球蛋白抗原性的影响

选用碱性蛋白酶处理大豆分离蛋白,间接竞争ELISA法测定水解物中β-伴大豆球蛋白的抗原性,响应面法优化降低β-伴大豆球蛋白抗原抑制率的最佳工艺条件。结果表明,碱性蛋白酶可以显著降低β-伴大豆球蛋白的抗原性,在一定程度上,水解度与β-伴大豆球蛋白抗原抑制率呈负相关关系。碱性蛋白酶在酶解时间40 min、加酶量3 000 U/g、温度55℃、p H 8.5条件下,β-伴大豆球蛋白抗原抑制率为33.48%,比大豆蛋白降低了64.16%。SDSPAGE结果显示,β-伴大豆球蛋白基本被酶解成小分子量肽段。     

大豆球蛋白酶解物清除DPPH自由基活性的研究

以7S和11S大豆球蛋白为原料,用Alcalase碱性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶制备大豆球蛋白酶解产物,分别测定其DPPH(1,1-二苯基苦酰基苯肼)自由基清除活力和水解度,从5种蛋白酶中筛选出碱性内切蛋白酶酶解物的清除活力最高,且相同水解时间的水解度最大.选择碱性蛋白酶为最佳水解酶,利用正交试验优化了其最佳水解条件,碱性内切蛋白酶水解7S和11S大豆球蛋白的最佳条件为:温度55℃,pH 8.0,酶用量5%,底物浓度4%.结果表明:在最佳水解条件下,7S大豆球蛋白酶解物的DPPH自由基清除活力比11S大豆球蛋白酶解物的高.     

一株产大豆蛋白酶的芽孢杆菌发酵条件的优化

对一株产大豆蛋白酶芽孢杆菌(Bacillussp.D-16-9)的发酵条件进行了优化,研究各种碳源、氮源及无机盐对产酶的影响,应用正交试验优化发酵培养基组成。结果发现菌株D-16-9可以利用无机氮源生长,但用来产酶则很差;有机氮源利于生长和产酶,适当添加诱导物更利于产酶;酶合成模式属于滞后合成型,大量收获在菌体生长的稳定期。通过试验确定发酵培养基的最佳组成:5.0%玉米粉、3.0%大豆豆粕、0.05%氯化钾0、.05%硫酸镁;确定最适发酵条件为:起始pH10,培养温度30℃、种龄24 h、接种量10%,250 mL三角瓶中装入100 mL发酵培养基,摇瓶转速170 r/min,发酵时间120 h。综合最佳的培养基组成和培养条件,最终大豆蛋白酶活达6 500 U/mL。优化后蛋白酶活性由4423.20U/mL提高到6505.60U/mL。