变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆、表达及生物信息学分析

采用聚合酶链式反应技术,从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆2-酮基葡萄糖酸激酶的全长基因kguK,并在此基础上构建了重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-kguK。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下,该重组菌株表达了一个特异的分子质量约为36.0 ku融合蛋白,且该蛋白的Western-Blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明,该蛋白是一种由305个氨基酸残基组成的亲水性蛋白,定位于细胞质中,存在着与pfkB家族蛋白类似的保守结构域,其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为35.73%、12.79%和51.48%。     

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸转运蛋白基因的克隆与分析

该研究旨在克隆变形假单胞菌JUIM01的2-酮基葡萄糖酸转运蛋白基因kgu T,并明确其基本的生物学信息。根据已报道的假单胞菌的基因组信息及其2-酮基葡萄糖酸操纵子的物理图谱设计简并引物,采用TD-PCR技术从变形假单胞菌中克隆到全长为1278 bp的kgu T,其核苷酸序列与Pseudomonas sp.CCOS191的编码2-酮基葡萄糖酸转运蛋白(Kgu T)的核苷酸序列的一致性为87%,编码一个由425个氨基酸残基组成的蛋白。该蛋白与Pseudomonas sp.M1的Kgu T在氨基酸序列上的一致性达90%,定位于细胞膜,是一个具有12个跨膜结构的疏水性的跨膜蛋白,无信号肽,其二级结构中α螺旋、延伸链和无规卷曲所占的比例分别为75.76%、2.12%和22.12%。本研究首次从2-酮基葡萄糖酸的工业生产用菌中克隆到基因kgu T,并对其进行了生物信息学分析,为变形假单胞菌的Kgu T的功能研究奠定了基础。     

2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌A46 抗噬菌体菌株的选育

从2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)A46的异常发酵液中分离到1种噬菌体，将其命名为KS461。透射电镜观察表明，KS461呈近球形，直径为52nm。以荧光假单胞菌A46为出发菌株，利用紫外诱变的方法，获得了4株对噬菌体KS461具有抗性的2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株，并研究了这些变异株的遗传稳定性。研究结果表明，经8次传代，这些变异株对噬菌体的抗性及其发酵产酸能力没有改变。     

利用荧光假单胞菌固定化细胞生产2- 酮基-D- 葡萄糖酸

以海藻酸钠为载体固定荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4,考察固定化细胞发酵生产2- 酮基-D-葡萄糖酸的条件。结果表明：利用5.0% 海藻酸钠制备的固定化细胞颗粒稳定性好,可重复利用7 次;发酵培养基中玉米浆的最适质量浓度为0.75g/100mL,固定化细胞的适宜发酵温度为30～36℃;在适宜的培养条件下,固定化细胞与游离细胞的2- 酮基-D- 葡萄糖酸产量及糖酸转化率基本相同,分别可达13.5g/100mL 和90.0% 左右。     

荧光假单胞菌AR4产2-酮基-D-葡萄糖酸发酵条件的研究

以淀粉水解糖为碳源,研究了不同氮源、碳氮比、金属离子、接种量以及环境因子(培养基起始pH值、通气量、温度)对抗噬菌体菌株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4产2-酮基-D-葡萄糖酸发酵的影响。结果表明,氮源、碳氮比、培养基的起始pH值、通气量及温度对该菌的产酸均有显著影响。在适宜培养条件下,该菌的摇瓶产酸及发酵转化率分别可达13.5%和90%左右。     

荧光假单胞菌JD1202利用大米淀粉水解糖连续发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸

研发荧光假单胞菌JD1202转化大米淀粉水解糖为2-酮基-D-葡萄糖酸的连续发酵工艺.考察了连续发酵起点、稀释率和补料培养基中葡萄糖浓度对2-酮基-D-葡萄糖酸生产的影响.结果表明,稀释率和葡萄糖浓度对2-酮基-D-葡萄糖酸发酵具有显著影响;在稀释率和补料培养基成分保持不变的条件下,2-酮基-D-葡萄糖酸大量合成期的任何时段均可作为连续发酵的起点,其细胞浓度、残糖浓度和2-酮基-D-葡萄糖酸浓度均稳定在一定范围.较适的连续发酵操作条件为:稀释率0.065h-1,补料培养基中葡萄糖的质量浓度为170.0g/L.在此条件下,连续发酵达到稳态时发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的质量浓度为130.34g/L,生产强度平均为8.47g/L·h,发酵转化率为89.46％.连续发酵工艺是一种高效的2-酮基-D-葡萄糖酸生产方法,有望应用于工业生产中.     

噬菌体污染对荧光假单胞菌K10052-酮基-D-葡萄糖酸发酵的影响

在实验室条件下，考察了噬菌体污染对荧光假单胞菌K1005的2－酮基－D-葡萄糖酸发酵的危害。研究结果表明，发酵早期的噬菌体污染减缓菌株对葡萄糖的利用，导致发酵周期大大延长和发酵转化率明显降低。     

荧光假单胞菌AR4在2-酮基-D-葡萄糖酸工业生产中的应用研究

在噬菌体存在的情况下,采用抗噬菌体菌株荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)AR4在200m3发酵罐上进行了2-酮基-D-葡萄糖酸的发酵生产。结果表明,荧光假单胞菌AR4对生产环境中噬菌体的抗性稳定,发酵周期短,发酵转化率高;经过10次传代,荧光假单胞菌AR4对噬菌体的抗性及其发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的能力没有改变;该菌株的发酵产物可以用于食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠的合成。     

补料分批培养生产2-酮基-D-葡萄糖酸的研究

研究了补糖对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AR4生产2-酮基-D-葡萄糖酸的影响,并在50kL发酵罐上进行了补料分批培养工业应用性试验。研究结果表明,采用补料分批培养方法,能有效提高发酵液中的产物浓度;开始补糖时发酵液中的残糖浓度以3%～6%为宜;补料分批培养方法及AR4菌株可用于2-酮基-D-葡萄糖酸的工业化规模生产中。     

一株2-酮基-D-葡萄糖酸(2KGA)产生菌的发酵研究

分离到一株能产生2-酮基-D-葡萄糖酸(2KGA)的菌株,经过16SrDNA测序,结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比较,鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida,本实验室命名为P.putida KD-1。本文研究了培养基组成中不同碳源、氮源、初始玉米浆浓度、补加葡萄糖浓度、初始pH和发酵控制pH对P.putida KD-1发酵生产2KGA产量的影响。检测2KGA采用两种方法,碘量法和高效液相色谱法。实验结果显示,以6%的葡萄糖、1%玉米浆为初始浓度,补加5%葡萄糖,初始pH6.7,发酵维持pH5.5,200rpm,30℃恒温培养96h,2KGA产量可以达到55g/L。表明该菌的发酵过程具有一定优化空间,可作为日后发酵产2KGA的新菌种。     

大豆过氧化物酶基因的克隆及其表达载体的构建

大豆过氧化物酶(soybean peroxidase,sbp)基因的克隆及其表达载体的构建将有利于人们更深入的从分子生物学角度研究sbp 基因的结构与功能。首先从大豆根中获取总RNA,通过RT-PCR 获得sbp 基因。再将sbp 基因与表达载体pPICZα-A 双酶切后连接,构建重组表达载体pPICZα-A-sbp。将pPICZα-A-sbp 转化大肠杆菌筛选阳性克隆体并测序。结果表明：获得的sbp 基因序列与已报道的sbp[U51191(GmEpa1)]基因序列有92% 的同源性。重组表达载体pPICZα-A-sbp 的成功构建为其在毕赤酵母中表达奠定了基础。     

芽胞杆菌XM-1酸性α-淀粉酶基因的克隆及原核表达

为使枯草芽胞杆菌XM-1菌株酸性α-淀粉酶基因高通量表达,提高酶产量,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出该酶基因As-Amy,并构建pET30a(+)/As-Amy原核表达载体,在大肠杆菌BL21中成功表达。测序结果表明As-Amy基因编码框全长为1434bp(Genbank登录号GQ153530),编码477个氨基酸,预测蛋白质分子质量为61ku。序列比对分析表明,As-Amy与多个枯草芽胞杆菌α-淀粉酶基因相似性在98%以上,所编码氨基酸与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis natto)IAM1212同源性最高。SDS-PAGE分析显示,As-Amy基因在大肠杆菌BL21中获得表达,酶活力较原菌株XM-1提高了2.7倍,表达蛋白分子质量大小与预测值相符。     

黑曲霉糖化酶基因在荧光假单胞菌中的表达

黑曲霉糖化酶基因cDNA按正确的读码框架克隆到广宿主表达载体pBBR1MCS-2,构建出含黑曲霉糖化酶基因的表达载体pBBR1MCS-2GA,用三亲和接合转化法将重组质粒导入2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株荧光假单胞菌AR4。得到重组菌ARW4,经SDS-PAGE凝胶电泳和Westernblot分析显示,黑曲霉糖化酶基因在ARW4中得到表达,表达产物主要以不溶性包涵体形式存在。     

裂殖壶菌鲨烯合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

为探讨裂殖壶菌烯合酶基因的克隆,以及在大肠杆菌中的表达。采用简并引物与RACE 相结合的方法从裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)中克隆出鲨烯合酶基因。分析表明该基因的cDNA 全长包括1672 个核苷酸,编码一个含446 个氨基酸的开放阅读框;在裂殖壶菌中以单拷贝的形式存在。同源分析显示裂殖壶菌鲨烯合酶的氨基酸序列中含有5 个保守基序。将裂殖壶菌鲨烯合酶的cDNA 序列连接到原核表达载体pGEX-4T-3 上构建融合表达载体,并在大肠杆菌BL21 中进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE 及Western blotting 分析结果显示,诱导表达出的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,其相对分子质量与预期相符;且融合蛋白具有一定的免疫原性。     

精氨酸脱亚胺酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化

通过PCR扩增得到菌株编码ADI的arcA基因,并构建表达载体pET24a-ADI。将该载体导入大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达ADI基因的重组菌。对ADI诱导表达条件进行优化,结果发现宿主菌在A600达到1.0时加入0.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),在30℃诱导4 h酶活最高,为2.04 U/mL发酵液。经超声波破碎、HiPrep DEAE FF阴离子交换层析、SuperdexTM200凝胶过滤层析,可获得SDS-PAGE电泳纯重组精氨酸脱亚胺酶(rADI)。rADI相对分子质量大小为92 600,由两个相同亚基组成,纯化后的rADI比酶活达20.9 U/mg。     

根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、 结构预测及原核表达

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶能够催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。为实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的异源表达,设计引物,克隆并分离其序列,通过生物信息学软件分析D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DNA和蛋白质的结构特点。结果表明,该基因开放阅读框870bp,编码289个氨基酸;蛋白质二级结构中α-螺旋占38.41%,β-折叠占47.06%,无规则卷曲占14.53%;该蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,定位于细胞膜;构建原核表达载体并导入E.coliBL21宿主中,表达的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶分子质量约为33kDa,1mmol/LIPTG诱导E.coliBL21重组菌28h后,目的蛋白表达量和酶活分别为0.32g/L和3.8U/mL。根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因能够在大肠杆菌中实现表达。     

哈密瓜中几丁质酶基因的克隆及表达分析

几丁质酶是一种重要的病程相关蛋白,在植物抗病中发挥积极作用。为研究哈密瓜中几丁质酶对青霉菌侵染的抗性作用,本研究采用RT-PCR的方法,克隆一段哈密瓜中几丁质酶基因的cDNA,并采用相对荧光定量法(SYBR Green)分析其表达量。克隆得到的几丁质酶基因片段HmCHI长1153 bp,最大开放阅读框为445个核苷酸,编码145个氨基酸,属于18家族Class Ⅲ几丁质酶基因;推测其所编码蛋白分子量为15.04 ku,理论等电点8.82,为疏水性蛋白;预测其有一个信号肽,为非跨膜蛋白,定位于细胞间隙;HmCHI氨基酸序列与黄瓜的亲缘关系最近。荧光定量分析显示,实验组的表达高峰出现时间较晚,维持高表达量的时间相对较长,上调幅度明显大于对照组。研究结果表明HmCHI可能在哈密瓜果实真菌胁迫响应中发挥重要作用。