食用植物油和地沟油中动物源性成分LAMP检测方法的建立

建立了食用植物油和地沟油中动物源性成分的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。针对猪、牛、鸡、鸭的线粒体Cytb基因分别设计2条外引物(F3、B3)、2条内引物(FIP、BIP)和2条环引物(FLP、BLP),着重对内引物FIP/BIP、甜菜碱和Mg2+浓度等反应参数进行了优化,扩增产物采用恒温实时荧光法检测。对方法的特异性和灵敏度进行了评价。实验结果表明,在0.2μmol/L外引物(F3和B3)、1.6μmol/L内引物(FIP和BIP)、0.8μmol/L环引物(FLP和BLP)、1 mol/L甜菜碱、6 mmol/L Mg SO4、1.6 mmol/L d NTP、反应温度63℃等参数的优化条件下,上述四种物源性成分的扩增效果最佳,该方法可以检测出动物油脂质量比例为1%及地沟油质量比例为5%的混合油脂中的动物源性成分。本方法对猪、牛、鸡、鸭源性成份的检测具有很高的特异性和灵敏度,可以用于油脂中动物源性成分的检测,为油脂的鉴伪和地沟油的鉴别提供技术支持。     

食品中驴源性成分环介导等温扩增检测方法的建立

建立食品中驴源性成分环介导等温扩增检测方法,对市售食品进行驴源性成分检测分析。针对驴的线粒体ATPase 6基因设计特异性引物,优化LAMP反应条件,验证引物的特异性和检出限。在DNA模板1.0μL,内引物FIP/BIP各1.6μL,外引物F3/B3各0.2μL, dNTPs 2.5μL, Mg~(2+)4μL, Bst DNA聚合酶缓冲液添加量2.0μL, Bst DNA聚合酶2.0μL体系下, LAMP法对食品中驴源性成分检测荧光可视法检测限为0.01%。LAMP方法检测食品中驴源性成分是切实可行的。与其他扩增技术相比,该方法具有操作简单、成本低、灵敏、快速的优势,适合于在基层单位进行推广应用。     

基于可视化环介导等温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌

应用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）建立基于颜色判定的快速、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法。根据金黄色葡萄球菌特异性靶基因SAR0395设计LAMP引物,建立可视化LAMP检测方法。优化的反应体系为：1.6 μmol/L内引物（FIP和BIP）,0.2 μmol/L外引物（F3和B3）,4.0 mmol/L MgSO4,1.0 mmol/L dNTPs,0.4 U/μL Bst 2.0 WarmStart? DNA聚合酶,120 μmol/L羟基萘酚蓝,扩增温度60 ℃,扩增时间60 min。在可视化LAMP体系中添加两条环引物（LF和LB）反应时间可缩短至20 min。该可视化LAMP反应60 min,其基因组灵敏度可以达到0.010 3 fg/μL,菌落灵敏度可以达到1.9 CFU/mL;利用46 株金黄色葡萄球菌和24 株非金黄色葡萄球菌证实该可视化LAMP具有良好的特异性和可靠性。本研究中建立的可视化LAMP可为金黄色葡萄球菌的快速检测提供一种新的技术。     

鉴别绵羊肉中狐狸源性成分的环介导等温扩增检测方法的建立

目的建立一种能够快速区分出绵羊肉中掺入的狐狸源性成分的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。方法针对狐狸线粒体Cox I基因分别设计两条外引物和两条内引物,优化LAMP反应条件后并进行特异性和灵敏性试验,对绵羊肉中狐狸源性成分进行检测。结果在0.2μmol/L外引物(F3和B3)、1.6μmol/L内引物(FIP和BIP)、0.5 mol/L甜菜碱、0.4 mmol/L d NTP、4 mmol/L Mg SO_4等参数的优化条件下,可检测出掺假率为1.0%的羊肉制品,即最低检测浓度为2×10~(-4)ng/μl。结论本文所建立的LAMP法特异性强、灵敏度高,能有效地对绵羊肉中狐狸源性成分进行检测,可作为羊肉掺假的一种快速检测方法。     

实时荧光环介导等温扩增技术检测婴儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的研究

目的建立实时荧光环介导等温扩增法(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测阪崎克罗诺杆菌。方法以阪崎克罗诺杆菌(基因号AY702093)16S~23S rRNA的保守序列进行引物设计,对dNTPs、Mg~(2+)及模板浓度等反应条件进行优化,并考察该方法的特异性和灵敏度。结果实时荧光LAMP法检测的最佳反应体系为:内引物1.6μL FIP和1.6μL BIP,外引物:0.5μL F3和0.5μL B3,2.5μL2.5mmol/L d NTP,2μL 4 mmol/L MgSO_4,3μL Buffer,1.6μL 10×Bst DNA聚合酶,3μL DNA模板,0.5μL 100×荧光染料,用灭菌双蒸水补足25μL体系,在63℃下反应60 min。除阪崎克罗诺杆菌之外其他菌株均没有产生特异性荧光扩增曲线。实时荧光LAMP检测克罗诺杆菌的灵敏度可达到8×10-2 CFU/mL。结论本方法检测克罗诺杆菌具有耗时短、特异性强及灵敏度高等优点,可为快速检测婴儿配方奶粉中的克罗诺杆菌提供参考。     

基于LAMP法快速检测羊肉及其制品中的猪、鸭和羊源性成分

目的建立肉制品中猪、鸭和羊源性成分的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,对市售羊肉片、羊肉卷、羊肉串进行猪、鸭和羊源性成分检测分析。方法针对猪、鸭和羊线粒体Cytb基因分别设计2条外引物、2条内引物和2条环引物,优化LAMP反应条件,对猪、鸭和羊源性成分进行特异性和灵敏度试验,对羊肉制品进行上述动物源性成分监测。结果在0.2μmol/L外引物(F3和B3)、1.6μmol/L内引物(FIP和BIP)、0.8μmol/L环引物(FLP和BLP)、1 mol/L甜菜碱、6 mmol/L Mg SO4、1.6 mmol/L d NTP等参数的优化条件下,LAMP法对肉制品中猪、鸭和羊源性成分的检测灵敏度达0.5%。SYTO-9荧光染料的荧光实时检测结果与SYBR Green I染料肉眼观察结果一致。调查发现,该批市售羊肉及制品中存在掺假现象,掺假率为34.5%。结论 LAMP法具有操作简便、特异性强、灵敏度高、检测结果准确的特点,能有效地对肉制品中的猪、鸭和羊源性成分进行检测,可作为羊肉制品掺假的一种快速检测方法。     

环介导等温扩增技术检测醋化醋杆菌

为实现醋酸菌的快速灵敏检测,以醋化醋杆菌为代表菌株,首次使用环介导等温扩增技术(LAMP)进行16S-23S ITS r RNA核酸扩增,通过特异性检测后对反应条件进行优化,并对扩增产物的检测方法进行比较。结果表明,该组引物特异性强,优化的25μL体系为:6 mmol/L Mg Cl2,1.4 mmol/L d NTPs,内引物(FIP和BIP)各0.8μmol/L,外引物(F3和B3)各0.2μmol/L,1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液,8U Bst DNA聚合酶,0.8 mmol/L甜菜碱,2μL DNA模板,用灭菌蒸馏水补足体系。62℃反应30 min即可完成扩增反应,产物经琼脂糖凝胶电泳后检测灵敏度达3.63×101CFU/m L。用肉眼观察白色焦磷酸镁沉淀,仅观察到3.63×102 CFU/m L以上的阳性产物,而在终产物中加入10 000×0.1μL SYBR GreenⅠ后,可通过肉眼观察产物颜色变化,得到与琼脂糖凝胶电泳法相同的检出限,并且缩短了检测时间。     

环介导等温扩增技术快速检测沙门菌

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下高特异、高效、快速地扩增靶序列的DNA扩增新技术.以沙门菌(Salmonella spp.)为研究对象,根据其特异性的invA基因,设计了一套特异性引物对该基因进行了LAMP,同时优化了其反应条件,建立了沙门菌的LAMP快速检测技术.结果表明,LAMP的最佳反应条件为外引物浓度5 pmol/L、内引物浓度40pmol/L,Mg2 浓度6mmol/L,dNTP浓度0.8mmol/L,甜菜碱浓度0.8mmol/L,Bst DNA聚合酶8u,反应温度63℃,反应时间1 h.在此条件下,LAMP检测沙门菌DNA的敏感度达10fg/反应,且与其他常见的细菌无交叉反应.其对牛奶样品的检出量为102cfu/mL,适合于食品中污染沙门菌的快速检测.     

环介导恒温扩增技术可视化检测携带tdh基因的致病性副溶血性弧菌

建立了环介导恒温扩增技术检测携带tdh基因的致病性副溶血性弧菌。基于副溶血性弧菌高度保守的tdh基因序列,设计了6条特异性引物,两条外引物F3、B3,两条内引物FIP、BIP及两条环引物LF、LB。在Bst DNA Polymerase作用下,60℃恒温水浴进行扩增。对10种细菌共21株菌进行LAMP扩增,所试6株副溶血性弧菌均为阳性,说明引物具有高度特异性。本LAMP方法对纯培养物的灵敏度可达到9.42cfu/m L。对污染食品中副溶血性弧菌的灵敏度为25.3cfu/25g,40~60min内即可完成检测。本方法操作简便、特异性强、灵敏度高,可以为临床提供简单、快速、高灵敏度和高特异性的检测应用。     

环介导等温扩增技术的研究进展

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是一种新型的恒温核酸扩增技术。与传统的PCR技术相比, 该技术能在恒定温度65 ℃条件下, 利用4条特异性设计的引物, 2条内引物(forward inner primer, FIP)、(backward inner primer, BIP)和2条外引物F3 primer、B3 primer和一种具有链置换特性的Bst.DNA聚合酶。在30~60 min内对目的DNA序列进行快速、高效扩增, 其扩增产物为大量的双链DNA。通过对产物的处理, 结合双链DNA特点, 根据目标DNA的含量直接或者间接得到待测物含量, 从而达到一个较高的灵敏度检测。利用该技术实现了在多种领域, 包括食品致病菌检测, 食品微生物含量检测以及生物医学等的广泛应用。本文主要对LAMP的技术原理、产物检测方法、应用领域、与其它方法比较的优缺点以及发展现状进行相关的论述。     

环介导等温扩增技术快速检测变形杆菌属的研究

建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测变形杆菌属(Proteus)的方法——环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。通过对GenBank中变形杆菌属atpD基因序列(AX109601)进行分析,设计了6条引物(2条内引物、2条外引物、2条环引物),在Bst大片段聚合酶的作用下,对模板DNA进行梯状等温扩增,产生白色沉淀,并且优化LAMP的反应体系,检验其灵敏性与特异性。扩增产物用限制性内切酶Psp1406Ⅰ(AclⅠ)酶切,观察酶切片段大小,验证方法的正确性。结果表明,该方法在61℃保温50 min即可完成,最低检测限为5.4 CFU/mL,灵敏度高于常规PCR 10倍。对其它食品病原菌进行检测,结果均未出现目的条带。表明LAMP法检测变形杆菌属灵敏度高、特异性好,操作简便,无需特殊的仪器设备,有恒温加热设备就可以满足检测条件,极适合在我国广大基层实验室开展应用。     

应用LAMP快速检测金黄色葡萄球菌的研究

建立环介导等温扩增技术(Loop-medisothermalamplification,LAMP)快速检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus).根据金黄色葡萄球菌nuc基因序列中的保守区域设计了4条特异性引物,在65℃等温条件下,45min即可扩增出梯形条带.LAMP检测金黄色葡萄球菌纯培养物的...     

葡萄球菌耐药基因aph的LAMP检测方法研究

随着抗生素大量而广泛的使用,细菌的耐药性已成为世界范围内关注的问题,对细菌携带耐药基因的检测已成为生物安全调查评估的新途径。本实验应用PCR方法扩增新霉素耐药基因aph,将其克隆于p EASY-T1载体并测序。通过Genbank同源性比较,在aph基因保守区设计了一套环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,通过对LAMP反应体系和反应条件的优化,建立了耐新霉素aph基因的LAMP检测方法,其最佳工作条件为:甜菜碱浓度为0.8 mol/L,Mg2+浓度为20 mmol/L,反应温度63℃,时间50 min。此方法可在60 min左右完成对aph基因的检测,特异性好。应用系列稀释的aph基因质粒进行敏感性检测比较,结果表明aph基因的LAMP检测灵敏度与PCR相当,检测限约20个拷贝。对38株葡萄球菌分离株的aph基因的LAMP检测表明,aph基因阳性携带率为84.2%。     

环介导等温扩增技术检测肉及肉制品中沙门氏菌

建立用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测肉及肉制品中沙门氏菌的方法。利用靶基因的6 个区段设计4 条引物,应用具有链置换活性的Bst DNA 聚合酶,能够在恒温(65℃左右)条件下特异、高效、快速地扩增待测物的DNA。针对沙门氏菌的特异基因invA 基因设计两对LAMP 引物,建立LAMP 检测沙门氏菌的新方法,并对肉及肉制品中的沙门氏菌进行检测。结果表明：建立LAMP 技术检测肉及肉制品中沙门氏菌的方法,该方法能够特异检测沙门氏菌,且灵敏性可达10-9CFU/mL,对48 份样品检测,该方法检出率为91.6%、敏感性100%、特异性70.0%、符合率为93.8%、检出时间1.5h。     

应用LAMP检测方法检测肉制品中的单增李斯特菌

本研究使用恒温环介导技术, 以单增李斯特菌的肌动蛋白大会诱导蛋白聚集因子A(actA)基因设计引物, 建立单增李斯特菌的LAMP快速检测方法.不同来源的13株单增李斯特菌LAMP检测均显示阳性, 其他21种细菌LAMP检测显示阴性.使用使用本研究建立的LAMP方法检测肉类样品中的单增李斯特菌结果与细菌分离方法检测结果一致.     

SENSITIVE AND RAPID DETECTION OF ENTEROBACTER SAKAZAKII IN INFANT FORMULA BY LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION METHOD

Enterobacter sakazakii is an emergent pathogen associated with ingestion of infant formula milk and was defined in category "A" of the hazard identification by FAO and WHO on microorganisms, which is based on the strength of evidence of a causal association between their presence in powdered infant formula and illness in infants. In this study, a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method has been developed for the detection of E. sakazakii in infant formula. The assay detected the species-specific DNA sequence of the 16S-23S rRNA internal transcribed spacer. The sensitivity of the detection is 1.2 cfu per 100 g infant formula with the selective enrichment. As the amplification is made under isothermal conditions, only a water bath or heating block is needed to maintain the required temperature. Thus, the method will be easily generalized and popularized in the future.

PRACTICAL APPLICATIONS

Enterobacter sakazakii is an emerging opportunistic pathogen associated with meningitis, bacteria and necrotizing enterocolitis in neonates. Powdered infant formulae have been implicated as the source of infection in neonatal meningitis. Thus, in order to minimize the hazard caused by E. sakazakii , it is of utmost importance to develop a rapid, sensitive and simple method for the early detection of this bacterium in infant formula.
In our study, the E. sakazakii was detected sensitively and rapidly in the infant formula by the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay. LAMP is easy to perform once the appropriate primers are prepared. The LAMP method will be a simple and rapid method for the scene detection of E. sakazakii as only four primers, a Bst polymerase and a regular laboratory bath are needed.     

可视化LAMP检测常见肉制品中猪肉成分

根据GenBank中公布的猪线粒体色素细胞b基因序列设计6 条特异性环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）引物,通过简化线粒体DNA提取步骤,优化反应体系,以常见的牛、羊、鸡、鸭、马、驴肉为阴性对照验证该方法的特异性,掺假率梯度稀释以验证该LAMP法的最低检测限,建立常见肉制品中猪肉成分的可视化LAMP检测方法。结果表明：该方法提取目的基因操作简单、稳定,该可视化LAMP检测法以4-(2-吡啶偶氮)-间苯二酚钠盐为指示剂,能准确检测出常见肉类中猪肉是否掺杂,检测结果肉眼可见,灵敏度为10 pg/μL。     

环介导等温扩增结合免疫层析试纸条快速检测羊肉及其制品中的鸭源成分

为实现肉及肉制品中掺假成分的快速检测,本文将环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification,LAMP)与免疫层析试纸条(immunochromatographic test strip,ICTS)相结合,建立了一套可在羊肉及其制品中特异并灵敏地检测出鸭源性成分的方法。根据鸭特异性细胞色素b(cytb)基因的6个特异性区域设计LAMP引物,其中两条内引物FIP和BIP分别使用生物素(biotin)和地高辛(digoxin)标记。使用LAMP扩增技术于65℃下扩增30 min产生生物素和地高辛标记的双链DNA产物,将扩增产生的双链DNA产物(10 μL)与90 μL上样缓冲液(PBS pH=7.4)混合均匀后使用免疫层析试纸条进行可视化检测。本研究所建立的LAMP-ICTS方法能够在40 min内特异性地检测出羊肉及其制品中的鸭源成分,且与其他肉类不存在交叉反应,检出限可达到0.01%(w/w)。市售实际样品检测结果显示,所采集的羊肉片、羊肉串样品中均有鸭源性成分,且此结果与行业标准方法(PCR-电泳)的检测结果一致。LAMP-ICTS方法具有灵敏度高、特异性好、检测速度快、对仪器的依赖低等优点,适用于基层监管部门对羊肉及其制品真伪进行快速检测。     

环介导等温核酸扩增技术快速检测食物中的大肠杆菌O157

建立了环介导等温核酸扩增技术(LAMP)检测食源大肠杆菌O157,并对该方法的灵敏度和特异性进行了评价。分别针对大肠杆菌O157三个特异基因rfbE,stx1和stx2的8个独立靶区域设计了外引物、内引物和环引物进行LAMP扩增检测,同时将检测结果与PCR方法做比较。研究结果表明,rfbE,stx1和stx2基因的LAMP方法检测限分别为100,100和10 fg DNA/管,灵敏度是PCR方法的10倍以上;将建立的环介导等温扩增法用于417株食物分离的大肠杆菌的检测,发现LAMP检测rfbE,stx1和stx2基因的灵敏度分别为100%,95.3%和96.3%,对3个靶基因的阴性预测率分别为100%,96.7%和97.1%,特异性和阳性预测率均为100%。结果表明,该方法用于大肠杆菌O157的检测具有特异性强、灵敏度高、操作简便的优越性,在食品安全检测方面具有良好的实际应用前景。