传统发酵蔬菜中抑制嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成乳酸菌的筛选与鉴定

目的:从来源于传统发酵蔬菜的乳酸菌中筛选对嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成有抑制作用的菌株。方法:采用牛津杯打孔法筛选乳酸菌菌株,测定其对N酰基高丝氨酸内酯(AHLs)信号分子的降解率。利用96孔板法测定其对生物膜的抑制率,应用光镜和扫描电镜观察其对生物膜形成的影响。最终通过生理生化试验和16S rRNA序列分析鉴定乳酸菌菌株。结果:分离自安徽绩溪酸豆角的菌株AJS2-4对嗜水气单胞菌群体感应有抑制作用,当其代谢产物粗提物质量浓度为4 mg/mL时,对嗜水气单胞菌AHLs的降解率为49.36%,对其生物膜抑制率为32.25%;当其质量浓度达到8 mg/mL时,可使嗜水气单胞菌的AHLs完全降解。该粗提物经121℃处理30 min活性基本不变,蛋白酶处理使其活性完全丧失,可初步判定菌株AJS2-4粗提物中的抑制群体感应活性成分为蛋白类物质,且具有热稳定性。光镜结果显示:菌株AJS2-4粗提物可有效抑制嗜水气单胞菌生物膜的合成。扫描电镜结果显示:菌株AJS2-4粗提物不仅能有效降低其生物膜的生成量,还可使其结构破裂变得疏松。经生理生化和16S r RNA鉴定菌株AJS2-4为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。结论:从安徽绩溪酸豆角中获得1株抑制嗜水气单胞菌群体感应和生物膜形成的植物乳杆菌AJS2-4。     

传统腌渍蔬菜中抑制嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成乳酸菌的筛选

从传统腌渍蔬菜分离的乳酸菌中筛选对嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成具有抑制作用的菌株。采用牛津杯打孔法从21株乳酸菌中筛选出具有抑制活性的6株乳酸菌,其中分离自辽宁大连酸黄瓜的菌株DLH513效果较好。当菌株DLH513粗提物质量浓度为16.0 mg/mL时,对嗜水气单胞菌AHLs信号分子降解率为51.1%,对其生物膜抑制率为40.9%;当粗提物质量浓度为20.0 mg/mL时,可使其AHLs信号分子完全降解。应用不同蛋白酶处理菌株DLH513粗提物后,对嗜水气单胞菌群体感应无抑制作用,表明其粗提物具有蛋白特性;在40～121℃处理30 min,其粗提物仍具有抑制群体感应活性,表明其粗提物具有耐热特征;在pH 3.0～4.5范围,菌株DLH513粗提物表现出抑制群体感应活性,在酸性条件下较稳定。光镜和扫描电镜结果表明,菌株DLH513粗提物对嗜水气单胞菌生物膜形成有显著的破坏作用。经生理生化反应和16S r RNA鉴定菌株DLH513为植物乳杆菌。研究表明植物乳杆菌DLH513可作为革兰氏阴性菌群体感应的抑制剂,以期为研发一种新的用于控制引起食品腐败和食源性疾病的革兰氏阴性菌群体感应的抑制剂提供理论基础。     

降解嗜水气单胞菌群体感应AHLs信号分子的乳酸菌筛选及淬灭作用

AHLs是一类介导革兰氏阴性菌群体感应的氮酰基高丝氨酸内酯类信号分子,从自然界中寻找对AHLs具有降解活性的乳酸菌,探究应用乳酸菌群体感应抑制剂控制致病菌的新途径。采用96孔板法从传统发酵食品和海水鱼肠道中分离的156株乳酸菌中初筛到56株对嗜水气单胞菌群体感应AHLs具有降解作用的菌株,初筛率为35.90%。采用琼脂扩散法对初筛菌株复筛得到12株降解活性较强的乳酸菌,其中来源于牙鲆肠道的菌株YP 4-1-1降解活性接近100%。GC-MS分析表明:菌株YP 4-1-1对嗜水气单胞菌C4-HSL和C6-HSL信号分子的降解活性分别为98.31%和81.81%。经生理生化和16S rRNA序列分析确定菌株YP 4-1-1为清酒乳杆菌。菌株YP 4-1-1酶解AHLs的活性来源于其粗细胞提取物的可溶性部分,可能是一种AHLs-酰基转移酶或氧化还原酶。YP 4-1-1粗提物对紫色杆菌CV026和嗜水气单胞菌的MIC分别为2.0 mg/mL和4.0 mg/mL,3个不同亚MIC(0.25 MIC,0.50 MIC,0.75 MIC)对紫色杆菌素的降解作用具有剂量依赖性。在体外共培养试验中,菌株YP 4-1-1可减弱嗜水气单胞菌溶血性、蛋白酶、DNA酶和嗜铁素等毒力因子的表达,并对其群体感应的群集和泳动行为具有抑制活性。本文从自然生态环境中获得对革兰氏阴性菌AHLs具有降解活性的乳酸菌,为研发乳酸菌生物制剂控制革兰氏阴性菌导致的水产动物疾病奠定理论和应用基础。     

鱼类肠道中抑制哈维氏弧菌群体感应及生物膜形成的乳酸菌的筛选和鉴定

从鱼类肠道来源的乳酸菌中筛选对目标菌—哈维氏弧菌群体感应及生物膜形成具有抑制作用的菌株。采用牛津杯打孔法从30株乳酸菌中筛选5株具有抗群体感应活性的菌株,其中源自鲤鱼肠道的菌株LY3-1的抑制效果较好,抑菌圈直径达14.21 mm。当菌株LY3-1粗提物质量浓度为8.0 mg/mL时,目标菌酰基高丝氨酸内酯(AHLs)信号分子的降解率为41.7%,生物膜抑制率为69.8%;当粗提物质量浓度为16.0 mg/mL时,可完全降解AHLs信号分子,生物膜抑制率达90.6%。菌株LY3-1粗提物经蛋白酶处理,群体感应抑制活性丧失,表明该粗提物中抑制群体感应的活性物质是蛋白质类物质。粗提物经40～121℃处理30 min,其群体感应抑制活性无显著性差异(P0.05),说明其具有热稳定性;同时,该粗提物在pH 3.5～7.0范围具有群体感应抑制活性。光镜和扫描电镜结果表明:菌株LY3-1粗提物对哈维氏弧菌生物膜形态结构具有显著破坏作用。菌株LY3-1经生理生化反应和16S rRNA测序被鉴定为乳酸乳球菌,其可作为哈维氏弧菌群体感应抑制剂。本研究结果为研发革兰氏阴性菌群体感应抑制剂提供理论基础。     

绿原酸对荧光假单胞菌群体感应现象及其腐败特性的抑制作用

首先以群体感应报告菌株紫色杆菌CV026检测模型,确定绿原酸的群体感应抑制活性,结合HPLC-MS/MS检测其对荧光假单胞菌释放信号分子的影响。以胞外酶活性、嗜铁素、群集与泳动为评价指标,通过添加外源信号分子分析绿原酸对荧光假单胞菌群体感应活性及腐败特性的调控作用。结果表明:在不影响荧光假单胞菌正常生长的剂量下,绿原酸可以减少其信号分子的产生,明显抑制荧光假单胞菌嗜铁素的产生、胞外蛋白酶、胞外脂肪酶活性、群集与泳动等相关腐败特性,且随着绿原酸浓度的升高,抑制效果更趋明显。因此,绿原酸具有较好的群体感应抑制活性,该研究为绿原酸作为群体感应抑制剂的开发提供了理论支持。     

戊糖片球菌YF-8对温和气单胞菌毒力因子及生物膜的影响

温和气单胞菌是水产品中常见的腐败菌,其致腐机制与群体感应密切相关,寻找淬灭群体感应的活性物质可以有效控制其致腐能力。本文选择对温和气单胞菌N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子具有降解活性的戊糖片球菌YF-8,研究其对温和气单胞菌毒力因子、生物膜及群体感应调控基因的影响。结果表明：亚最小抑菌浓度的YF-8乙酸乙酯粗提物（2.0,4.0 mg/mL和6.0 mg/mL）对温和气单胞菌蛋白酶、胞外多糖、嗜铁素、溶血性、泳动能力的抑制率分别为9.6%～32.72%,17.91%～58.09%,19.04%～44.35%,19.21%～51.49%,51.61%～93.55%,且呈质量浓度依赖性。此外,3个亚最小抑菌浓度的YF-8粗提物对温和气单胞菌生物膜形成抑制率和清除率分别为31.28%～66.64%和6.7%～29.88%,结构上可使其厚度变薄,菌体稀疏、松散。6.0 mg/mL的YF-8粗提物可使温和气单胞菌群体感应调控基因LuxI和LuxR的相对表达量分别下调69.48%和80.76%。本研究为控制由温和气单胞菌导致的水产品腐败及病害提供了新的思路。     

基于群体感应研究丹皮提取物对嗜水气单胞菌致腐性的抑制作用

首先利用报告菌株紫色杆菌CV026检测模型,确定丹皮提取物具有群体感应抑制活性,然后以从腐败大菱鲆中分离得到的嗜水气单胞菌(Ah-11)为测试对象,以信号分子产生、生物被膜形成、嗜铁素产生、蛋白水解活性以及细菌迁移(群集和泳动)为评价指标,研究丹皮提取物对Ah-11群体感应的抑制作用,并添加外源AHLs分析Ah-11致腐性与其QS系统之间的联系。结果表明,AHLs能够调控Ah-11致腐因子的产生;能够减少Ah-11信号分子的产生,而不影响嗜水气单胞菌的生长速度;能够显著减少其生物被膜的形成量(P0.05),破坏生物被膜的结构,降低其蛋白水解活性(P0.05),抑制其迁移能力(群集和泳动),且抑制作用具有质量浓度依赖性。当丹皮提取物质量浓度为1 mg/m L时,对生物被膜、蛋白水解活性、群集现象和泳动的抑制率分别达到65.47%,43.46%,26.94%和51.68%;嗜铁素试验表明丹皮提取物可能含有能够螯合铁的化合物。     

植物乳杆菌XCT-1对温和气单胞菌群体感应及生物膜形成的抑制作用

利用双层琼脂扩散法从辽宁葫芦岛农家腌芥菜中获得对温和气单胞群体感应有较强抑制活性的菌株XCT-1,该菌株经生理生化和16S r RNA序列被鉴定为植物乳杆菌。4 mg/mL菌株XCT-1代谢产物的粗提物对温和气单胞菌生物膜的抑制率为38%,显微镜观察显示其粗提物能够减少细菌生物膜的形成。扫描电镜结果表明:菌株XCT-1粗提物不仅降低了温和气单胞菌生物膜的生成量,而且使其生物膜结构疏松。菌株XCT-1粗提物经100℃30 min后其抑制活性保持不变,而经胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶处理后活性完全丧失。初步确定菌株XCT-1粗提物中的群体感应抑制成分为蛋白类物质,具有热稳定性。研究表明菌株XCT-1粗提物中的蛋白类物质主要通过干扰温和气单胞群体感应系统抑制其生物膜的形成。     

面包乳杆菌ZHG2-1对荧光假单胞菌群体感应的淬灭作用

以紫色杆菌CV026为指示菌株，验证面包乳杆菌ZHG2-1群体感应淬灭活性，检测其对荧光假单胞菌生物膜、致腐因子表型以及相关基因表达水平的影响，探究面包乳杆菌ZHG2-1对荧光假单胞菌群体感应的淬灭机制。结果表明:菌株ZHG2-1无细胞上清液对荧光假单胞菌AHLs的降解活性为100%。在亚抑制质量浓度(1.0，2.0，3.0 mg/mL)下，菌株ZHG2-1粗提物对荧光假单胞菌生物膜的抑制率和清除率分别为在9.66%~31.32%和28.62%~62.82%范围，对胞外多糖、蛋白酶、脂肪酶、生物胺等致腐因子抑制率在7.23%~100%范围，并呈质量浓度依赖性。扫描电镜结果表明亚抑制质量浓度的菌株ZHG2-1粗提物处理使其生物膜量显著减少，细菌菌落处于分散状态。qRT-PCR结果显示，菌株ZHG2-1粗提物对荧光假单胞菌群体感应基因rhlI和rhlR分别下调0.93和0.99，aprX、algA、orm、flgA、ldcA等生物膜和致腐基因的表达水平也被显著抑制，说明面包乳杆菌ZHG2-1通过干扰荧光假单胞菌群体感应基因的表达，影响其生物膜和腐败因子的产生。本研究结果为开发水产品新型生物防腐剂提供理论依据。     

乙基麦芽酚对杀鲑气单胞菌群体感应及腐败活性的抑制作用

本研究利用群体感应报告菌株紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）026鉴定乙基麦芽酚的抗群体感应活性,通过气相色谱-质谱定量检测分析乙基麦芽酚对杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonida）分泌信号分子的影响。添加外源信号分子,以生物被膜形成量、胞外蛋白酶活力、细菌运动性（群集和泳动迁移直径）为指标,分析乙基麦芽酚对杀鲑气单胞菌群体感应及腐败活性的抑制作用。结果表明：乙基麦芽酚对紫色杆菌026以及杀鲑气单胞菌的最小抑菌浓度为0.1 mg/mL,在亚抑菌浓度下,乙基麦芽酚可降低紫色杆菌026产紫色杆菌素的能力;气相色谱-质谱定量检测结果显示,乙基麦芽酚对杀鲑气单胞菌所产群体感应信号分子C12-高丝氨酸内酯的分泌具有明显的抑制作用;且0.08 mg/mL乙基麦芽酚对杀鲑气单胞菌生物被膜形成、胞外蛋白酶活力和细菌运动性（群集和泳动）的抑制率分别为71.2%、69.1%、80.4%和82.1%,且抑制作用具有浓度依赖性。由此可见,乙基麦芽酚对杀鲑气单胞菌具有较强的群体感应抑制效果,有望作为群体感应抑制剂用于水产品保鲜。     

粪肠球菌Z096对副溶血弧菌生物被膜及群体感应的抑制作用

为了研究粪肠球菌Z096对副溶血弧菌生物被膜和群体感应（quorum sensing,QS）系统的抑制作用,采用竞争、清除、排阻三种方式模拟Z096与副溶血弧菌在微菌落环境中的相互作用,并进一步探究了Z096的提取物（Z096-E）对副溶血弧菌生物被膜形成、成熟生物被膜清除、细胞表面疏水性、自聚性、QS信号分子AI-2活性、群集泳动能力以及胞外多糖和蛋白合成的影响。结果表明:Z096可通过竞争、清除、排阻的方式与副溶血弧菌相互作用,降低浮游和生物被膜状态的副溶血弧菌细胞数量,干扰副溶血弧菌在载体表面的粘附,且Z096-E能够显著抑制副溶血弧菌生物被膜形成,有效清除成熟生物被膜,1.6 mg/mL的Z096-E处理12 h,副溶血弧菌生物被膜抑制率为70.43%,代谢活性减少率为84.15%;12.8 mg/mL的Z096-E处理副溶血弧菌成熟生物被膜4 h,生物被膜清除率为58.21%,代谢活性减少率为69.84%。而且1.6 mg/mL的Z096-E对副溶血弧菌群集和泳动能力、细胞表面疏水性和自聚性、胞外多糖和蛋白合成的抑制率分别为47.26%、53.56%、63.37%、89.38%、77.65%和51.91%,抑制效果具有浓度依赖性。此外,Z096-E可使副溶血弧菌QS信号分子AI-2活性减弱,表明Z096-E是一种AI-2类群体感应抑制剂,其可通过干扰QS系统,从而影响副溶血弧菌的生理特性。因此,本研究发现了一株能够抑制副溶血弧菌生物被膜的乳酸菌,其提取物Z096-E能作为一种防控副溶血弧菌生物被膜的新型乳酸菌生物制剂,这对消除致病菌生物被膜污染以及开发新型抗菌剂具有积极的作用。     

富马酸钠对荧光假单胞菌群体感应现象及其腐败活性的抑制作用

以报告菌株紫色杆菌CV026为检测模型,探究富马酸钠对荧光假单胞菌群体感应现象及其腐败特性的影响。采用酶标法及光学显微镜观察富马酸钠对荧光假单胞菌生物被膜的抑制效果,利用气相色谱-质谱分析富马酸钠对荧光假单胞菌分泌信号分子的影响。结果表明：在亚抑菌浓度下,富马酸钠可以显著降低紫色杆菌CV026紫色菌素的产生量（P＜0.05）;当质量浓度为2.0 mg/mL时,富马酸钠对紫色菌素的抑制率达50.95%,且不影响CV026菌株的生长。富马酸钠能有效抑制荧光假单胞菌生物被膜形成、群集与泳动、胞外蛋白酶活性等相关腐败特性,且质量浓度与其抑制作用呈正相关。另外,由气相色谱-质谱检测结果可知,富马酸钠对荧光假单胞菌N-酰基高丝氨酸内酯信号分子的分泌有较好的抑制效果。因此,富马酸钠具有较好的群体感应抑制活性,可作为新型群体感应抑制剂用于水产品贮藏保鲜。     

基于群体感应研究苦丁茶多酚对荧光假单胞菌腐败特性的抑制作用

为探究苦丁茶多酚对分离自卵形鲳鲹的腐败菌荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的抑制作用,本文以报告菌株紫色杆菌(Chromobacterium violaceum) CV026 为检测模型,测定了苦丁茶多酚对细菌的群体感应抑制活性,以胞外酶活性、生物被膜形成量及形态、群集与泳动性为指标,测定了苦丁茶多酚对荧光假单胞菌腐败特性的抑制作用。结果表明:苦丁茶多酚对CV026、荧光假单胞菌的最小抑菌浓度分别为2.1、3.0 mg/mL;在亚抑菌浓度下,苦丁茶多酚可以显著降低紫色杆菌CV026 紫色菌素的产生量（P<0.05）;当浓度为2.0 mg/mL 时,对紫色菌素的抑制率达68.89%,且不影响CV026 菌株的生长;苦丁茶多酚能有效抑制荧光假单胞菌胞外酶活性、生物被膜形成、群集与泳动能力等相关腐败特性,其抑制作用呈剂量依赖性,苦丁茶多酚浓度为2.0 mg/mL时,对蛋白酶、脂肪酶活性、生物被膜形成、群集和泳动能力的抑制率分别达到80.68%、53.50%、44.90%、79.56%和90.12%;苦丁茶多酚具有较好的群体感应抑制活性,可以为新型天然群体感应抑制剂研发提供参考。     

钝顶螺旋藻提取物对细菌群体感应的抑制作用

以mini-Tn5突变株Chromobacterium violaceum CV026为报告菌检测系统,研究钝顶螺旋藻甲醇提取物的群体感应抑制活性及对大菱鲆腐败菌Shewanella putrefacens生物膜形成的影响。结果表明:螺旋藻75%甲醇提取物(0.125～1.000g/100mL)不仅能显著降低Chromobacterium violaceum CV026细菌紫色菌素的产生,而且能显著抑制外源信号分子N-已酰化高丝氨酸内酯(10μmol/L C6-HSL)诱导的报告菌紫色菌素的增加。当螺旋藻提取物添加质量浓度为1.000g/100mL时,对报告菌紫色菌素的抑制率达87.67%,对Shewanella putrefacens生物膜的形成抑制率达77.05%,与对照差异均达显著水平(P<0.05)。抑菌实验表明,在给定的质量浓度范围内,螺旋藻提取物对报告菌的生长无显著影响;螺旋藻提取物抑制紫色色素的产生与生物膜的形成不是通过抑制细菌的生长来实现的,而与抑制信号分子诱导的群体感应现象有关;螺旋藻提取物具有较强的细菌群体感应抑制活性,可作为细菌群体感应抑制剂用于新鲜食品及其制品的贮藏与保鲜。     

1,10-癸二醇对杀鲑气单胞菌群体感应的抑制作用

本研究以1,10-癸二醇（1,10-decanediol）为研究对象,通过紫色杆菌CV026特征性紫色菌素的产生对1,10-癸二醇的抗群体感应活性进行验证,并在亚抑菌浓度条件下探究1,10-癸二醇对杀鲑气单胞菌群体感应现象及腐败特性的抑制作用。研究结果表明,1,10-癸二醇对杀鲑气单胞菌的胞外蛋白酶活性、群集与泳动能力和生物被膜形成等相关腐败特性均具有较强的抑制作用,而且其抑制效果呈浓度依赖性增强。当1,10-癸二醇的质量浓度为0.4 mg/mL时,杀鲑气单胞菌的胞外蛋白酶活性明显减弱,运动能力也变得很弱,生物被膜的形成率降低了76.92%;通过扫描电镜观察生物被膜形态,发现随着1,10-癸二醇溶液浓度增大,生物被膜表面形成的裂缝会逐渐变多,直至完全龟裂,最终会使生物被膜的面积减小。由此可见,1,10-癸二醇具有较好的群体感应抑制效果,可以作为新型的群体感应抑制剂用于水产品保鲜。     

与己醛具有群体感应协同抑制效应的精油成分组合筛选研究

为了减少精油作为抗菌剂的实际使用量,研究了对胡萝卜软腐欧氏杆菌(蔬菜腐败菌)的群体感应具有协同抑制作用的精油成分组合。基于胡萝卜软腐欧氏杆菌的最小抑菌浓度和分级抑菌浓度,从9种精油成分中筛选出与己醛具有协同抑菌作用的4个精油成分组合,利用紫色杆菌CV026和胡萝卜软腐欧氏杆菌筛选其中对二者群体感应具有协同抑制效应的精油成分组合,进一步利用能够判别两种物质是否具有协同作用的金氏公式验证,发现己醛只有与香叶醇组合才具有较好的群体感应协同抑制效果,而且有效浓度仅为己醛和香叶醇单体最小抑菌浓度的1/8和1/16。该组合对紫色杆菌CV026和胡萝卜软腐欧氏杆菌的群体感应相关指标均具有较好的抑制效果,其中群体感应指标中的产紫色菌素、游泳运动、群集运动、产胞外多糖和生物被膜形成的抑制率分别为52.91%、58.19%、51.49%、65.03%和69.84%。通过扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜进一步观察到己醛联合香叶醇对胡萝卜软腐欧氏杆菌生物被膜的形成具有明显的破坏作用。研究结果表明,具有协同抑制腐败菌群体感应作用的己醛与香叶醇组合,可以在降低精油成分实际使用量的同时,有效抑制腐败菌的腐败特性。     

淬灭副溶血弧菌群体感应的乳酸菌益生特性研究

以副溶血弧菌的群体感应为靶标,筛选对副溶血弧菌群体感应和生物被膜形成具有抑制作用的乳酸菌菌株,分析其益生特性。采用哈维氏弧菌BB170生物发光法及结晶紫染色法测定10株乳酸菌淬灭副溶血弧菌群体感应和抑制生物被膜形成的效果,并分析其自聚性、共聚性、疏水性、生物被膜形成能力以及抗菌谱。结果表明,10株乳酸菌对副溶血弧菌生物被膜形成的抑制作用存在明显差异,乳酸菌抑制副溶血弧菌AI-2活性与抑制生物被膜形成具有相关性,其中菌株A10对副溶血弧菌AI-2和生物被膜的抑制率分别为82.92%和87.70%,对副溶血弧菌AI-2活性有促进作用的菌株B11、L18基本对生物被膜形成没有抑制作用;菌株MS1的自聚率和疏水率均达到80%以上,成膜能力强,且其淬灭副溶血弧菌群体感应和抑制生物被膜形成的作用明显,抑制率分别为69.54%和77.32%,抗菌作用强。本研究为乳酸菌源群体感应抑制剂的研究开发提供参考,对乳酸菌资源的充分开发利用具有积极意义。     

戊糖乳杆菌DF9对副溶血弧菌群体感应的淬灭作用

以副溶血弧菌的群体感应(quorum sensing,QS)为靶标,研究戊糖乳杆菌DF9的乙酸乙酯提取物作为群体感应抑制剂(QS inhibitor,QSI)对其的淬灭效果.在确定DF9-QSI对副溶血弧菌和哈维氏弧菌BB170生长影响的基础上,探讨亚抑菌浓度的DF9-QSI对副溶血弧菌QS信号分子AI-2的活性、动力...