重组酿酒酵母全细胞催化合成莱鲍迪苷A

用经密码子优化后合成的甜叶菊UDP糖基转移酶UGT76G1编码基因构建了表达该酶的重组酿酒酵母YPH499(pYES2-UGT)。建立了通过柠檬酸钠调节酿酒酵母细胞内由葡萄糖到尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的代谢通量,用于催化甜菊苷合成莱鲍迪苷A的全细胞催化方法。优化后的催化体系为:甜菊苷1 g/L,葡萄糖20g/L,普郎尼克F68 10 g/L,MgCl2 6 g/L,柠檬酸钠15 g/L,pH 7.2,细胞密度200 g湿细胞/L反应液,在37℃下经72 h后转化生成莱鲍迪苷A 267.89 mg/L。     

新型甜味剂莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的生物转化进展

来源于植物甜叶菊的天然甜味剂莱鲍迪苷D(rebaudioside D,Reb D)和莱鲍迪苷M(rebaudioside M,Reb M)具有高甜度、无热量和近似于蔗糖的口感,被认为是高热量糖的理想替代品,其在食品领域具有广阔的应用前景。文章综述了Reb D和Reb M的结构、口感、水溶性、安全性以及合成相关的糖基转移酶的研究进展,并重点介绍了Reb D和Reb M合成相关的糖基转移酶的蛋白质结构、催化机制以及蛋白质理性改造的研究进展,以期为Reb D和Reb M的开发和应用提供参考。     

构建高效糖配体再生重组菌生物催化合成莱鲍迪苷D

利用拟南芥（Arabidopsis thaliana）蔗糖合酶AtSUS3构建活化糖配体尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose,UDPG）再生体系,与高效催化莱鲍迪苷D（rebaudioside D,RD）合成的糖基转移酶协同偶联完成RD的高效生物催化。从拟南芥cDNA克隆获得AtSUS3基因,将其装配至pET28a获得表达质粒pLW105,随后pLW105与携带糖基转移酶EUGT11基因的质粒共转化大肠杆菌BL21（DE3）构建双酶共表达工程菌。在不添加UDPG或者尿核苷二磷酸（uridine diphosphate,UDP）的条件下,以上述双酶共表达工程菌全细胞催化莱鲍迪苷A（RA）获得的底物摩尔转化率大于80%,RD产量达到930?mg/L。随后构建双酶基因串连质粒pLW108及双酶共表达大肠杆菌BL21（DE3）工程菌。用串连质粒构建的工程菌催化效果与双质粒共转化相同。采用共表达双酶工程菌的发酵破碎粗酶进行催化,结果显示以粗酶催化可简化催化体系,并可将细胞催化体系所需高质量浓度蔗糖用量降至质量浓度5 g/100 mL,同时在不添加外源UDPG的条件下实现RD的高效生物催化,RA底物摩尔转化率达到93%,RD产量约为1?051?mg/L。     

新型天然高倍甜味剂—莱鲍迪苷A

综述了莱鲍迪苷A的物化性质、制备、检测方法和应用等方面的研究进展,并对莱鲍迪苷A在食品工业中的应用和前景进行了分析及阐述。     

毕赤酵母全细胞催化合成新型高倍甜味剂莱鲍迪苷A

本研究构建经密码子优化后的UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶AtSUS基因的重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9KUGT/p PICZA-At SUS,实现双酶在毕赤酵母中的胞内共表达。利用共表达菌株作为全细胞催化剂在体外进行催化反应,可成功将ST转化为RA,并在此基础上对其最适反应温度、反应p H、底物UDP浓度与底物蔗糖浓度条件进行优化。重组菌株经甲醇诱导,对不同发酵时间菌体的催化能力进行探究,确定发酵120 h菌体催化能力最佳,RA产量为0.58 mg/mL。对共表达菌株催化体系中全细胞催化条件进行优化,优化后的催化体系为:反应pH 7.0,UDP浓度1 mM,蔗糖浓度70 mM,MgCl_2浓度3 mM,ST浓度10 mg/mL,将OD_(600)为30的细胞与上述体系混合后在最适温度45℃下,200 r/min反应15 h,重组菌可将10 mg/mL ST转化为7.46 mg/mL RA,为RA酶法生物合成及其产业化应用提供技术支持。     

莱鲍迪苷A复配甜味剂在蛋糕中的应用

通过感官评定的方法研究莱鲍迪苷A在蛋糕中替代蔗糖的应用效果。在此基础上研究莱鲍迪苷A复配甜味剂对蛋糕感官品质和质构的影响,确定复配甜味剂的最优配方。结果表明,莱鲍迪苷A在蛋糕中替代蔗糖的最大替代量为30%。莱鲍迪苷A复配甜味剂的加入对蛋糕的内聚性、粘度影响不大,对蛋糕硬度、弹性、胶着性、咀嚼性的影响显著。添加适当比例的复配甜味剂可以使蛋糕的弹性、胶着性有所增加,同时改善了蛋糕的咀嚼性,使蛋糕的口感更加绵软,甜味更加柔和,保湿性也得到明显改善。蛋糕的最优配方为:面粉100g,鸡蛋150g,色拉油20g,泡打粉2g,蔗糖10g,莱鲍迪苷A 0.1g,木糖醇45g,聚葡萄糖30g。     

莱鲍迪苷A甜味剂在功能性酸奶中的应用研究

用莱鲍迪苷A替代蔗糖后,酸奶的色泽较对照组更白,凝乳状态基本没有发生变化,酸奶凝乳好,表面光滑。但酸奶的持水性能明显下降,在酸奶的表面均出现乳清析出。随着莱鲍迪苷A替代量的增加,酸奶的酸味评分先增加后下降,但普遍低于对照组。同时,酸奶的甜味、苦味和柔和感评分与对照组相比都有所下降。相反地,酸奶的乳香味评分有所上升。当莱鲍迪苷A替代蔗糖后酸奶的各项感官品质普遍下降,综合分析可知莱鲍迪苷A的最优替代量为50%。但是,当替代量为50%时,酸奶的乳清析出比较明显,而且酸甜不和谐,口感不够柔和,如果要用莱鲍迪苷A制作无糖酸奶还需要对其进行复配。在单因素试验的基础上以莱鲍迪苷A、赤藓糖醇、低聚异麦芽糖用量为自变量,酸奶感官、pH、硬度、稠度、黏附性、持水力为响应值,对酸奶复合甜味剂配方进行响应面优化。优化后无糖酸奶的最优配方为:复原乳100mL,莱鲍迪苷A 0.02 g,赤藓糖醇1.809 g,低聚异麦芽糖2.908 g,稳定剂0.1 g,CaCl20.02 g,接种量4 mL。用该配方制作的无糖酸奶色泽洁白,结构均匀细腻,酸甜适宜,口感柔和。     

体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶 高效催化合成莱鲍迪苷A

本研究构建了UDP-糖基转移酶UGT76G1基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-UGT76G1和绿豆来源的蔗糖合成酶(mbSUS)基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K/pPICZA-mbSUS。通过甲醇诱导产酶,制备UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶,并构建生物催化级联反应体系,生物催化甜菊糖苷(Stevioside,ST)合成莱鲍迪苷A(rebaudioside A,RA),有效实现了级联反应体系中尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的循环利用。本研究通过反应条件优化,发现级联反应中的限速酶是糖基转移酶UGT76G1,添加酶活比例为U_((UGT76G1)):U_((mbSUS))=6:1为合成莱鲍迪苷A的最佳酶活比例,在pH7.0,UDP浓度1mM,蔗糖浓度50mM,MgCl_2浓度3 mM的反应条件下,10 mM ST转化合成8.20±0.11 mM RA,RA的产率达到82.91%,与在大肠杆菌表达系统中相比,极大缩短了催化反应时间。利用体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶催化合成RA为酶法高效生物合成RA及其产业化应用提供技术支持。     

高效液相色谱法测定蜜饯中的莱鲍迪苷A的含量

甜菊糖苷是一种混合天然甜味剂,其中以莱鲍迪苷A甜度最高,在食品中应用最广。本试验建立了蜜饯中莱鲍迪苷A(RA)含量测定的高效液相色谱(HPLC)方法,分析采用Kromasil NH2色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),以75%的乙腈水为流动相,通过二极管阵列紫外检测器进行检测。该方法在0.025 0.50mg/mL范围内线性关系良好,相关系数r=0.99991,最低检出限为0.011g/kg,相对标准偏差RSD为0.41%(n=8),加标回收率在92.7%110%之间。本方法回收率高、灵敏度高,且更高效快捷,适用于蜜饯中甜菊糖苷类添加剂的检测,可以为食品安全国家标准的有效实施提供技术保障。     

大孔树脂D392对莱鲍迪苷A和甜菊苷吸附作用的研究

根据莱鲍迪苷A(RA)比甜菊苷(S)多一个葡萄糖基的特点,针对性地选择了14种工业树脂,分别考察了它们对RA和S的吸附能力和吸附选择性。在此基础上,研究了吸附选择性较高的大孔树脂D392的吸附动力学和吸附热力学,并考察了温度、甜菊糖苷水溶液浓度、pH、溶剂对D392吸附选择性的影响规律。结果表明,D392在水相中对S的吸附能力大于对RA的吸附能力,吸附为放热过程,且在较低温度下吸附选择性较好。在298.15K,pH7.0,混合糖苷(RA/S=1∶1)浓度为5g/L时,经D392吸附6h,吸附残液中RA/S达到最大值。进一步以RA含量70.3%的甜菊糖苷作供试液,经D392吸附6h,吸附残液中RA含量可提高到88.4%,RA保留率为68.0%。      

天然甜味剂瑞鲍迪甙A在烟用接装纸上的应用

为丰富烟用接装纸上甜味剂的种类,拓展天然香原料在卷烟生产中的应用,在维持现有甜味接装纸产品风格的基础上,探讨了天然甜味剂瑞鲍迪甙A应用于烟用接装纸的生产方法,研究了其水性油墨配方及接装纸全涂布制作工艺,对成品接装纸的物理性能和卫生指标进行验证,并对成品接装纸和成品卷烟进行感官评价。结果表明:①天然甜味剂瑞鲍迪甙A具有甜度较高、味感品质好的优点,适用于烟用接装纸。②涂布工艺选择全涂布,能有效避免色差问题,保证接装纸的上机适应性。③以柠檬酸∶瑞鲍迪甙A ∶水性油墨=1 ∶ 20 ∶ 1 000（质量比）配制的瑞鲍迪甙A的水性油墨配方能有效改善口感且符合生产需要。④涂布有天然甜味剂瑞鲍迪甙A的成品接装纸的物理指标和卫生指标均符合技术要求,能够满足生产上机适应性和消费者体验需求。⑤所卷制的成品卷烟样品口感绵甜纯正、余味深长,可突出卷烟的绵甜甜味风格。      

重组褐藻胶裂解酶基因工程菌的高密度培养

在5L发酵罐中,利用分批补料培养技术高密度培养含表达褐藻胶裂解酶重组质粒的工程菌E.coliBL21,生产褐藻胶裂解酶。利用单因素实验对补料培养基中碳源浓度进行优化,利用单因素实验和单纯形优化法对诱导时间和IPTG浓度进行了优化,从而得到最适高密度发酵条件为:发酵培养基为葡萄糖10g/L,酵母提取物5g/L,蛋白胨20g/L;补料培养基为葡萄糖150g/L,蛋白胨20g/L,酵母提取物10g/L,4～10h的流加速率为100mL/h,10～16h的加速率设定为200mL/h;诱导时间为4.5h,IPTG终浓度为0.60mmol/L,发酵过程中溶解氧控制在30%～40%,pH控制在7.0～7.2。IPTG未诱导时,最终发酵液中菌液稀释200倍后,OD₆₀₀达0.696,菌体浓度达65.38g/L;IPTG诱导后菌液稀释200倍后,OD₆₀₀达0.457,菌体浓度达60.15g/L,是分批发酵的8.43倍;菌体进行超声波破碎后制备粗酶液,酶活力达26.37U/mL,是分批发酵的5.48倍。      

重组褐藻胶裂解酶基因工程菌的高密度培养

在5L发酵罐中,利用分批补料培养技术高密度培养含表达褐藻胶裂解酶重组质粒的工程菌E.coli BL21,生产褐藻胶裂解酶.利用单因素实验对补料培养基中碳源浓度进行优化,利用单因素实验和单纯形优化法对诱导时间和IPTG浓度进行了优化,从而得到最适高密度发酵条件为:发酵培养基为葡萄糖10g/L,酵母提取物5g/L,蛋白胨20g/L;补料培养基为葡萄糖150g/L,蛋白胨20g/L,酵母提取物10g/L,4～10h的流加速率为100mL/h,10～16h的加速率设定为200mL/h;诱导时间为4.5h,IPTG终浓度为0.60mmol/L,发酵过程中溶解氧控制在30％ ～40％,pH控制在7.0～7.2.IPTG未诱导时,最终发酵液中菌液稀释200倍后,OD600达0.696,菌体浓度达65.38g/L;IPTG诱导后菌液稀释200倍后,OD600达0.457,菌体浓度达60.15g/L,是分批发酵的8.43倍;菌体进行超声波破碎后制备粗酶液,酶活力达26.37U/mL,是分批发酵的5.48倍.     

高温微好氧发酵策略强化重组大肠杆菌D-乳酸合成途径

D-乳酸作为一种重要的手性中间体和聚乳酸合成的原料,其生产已越来越受到人们的重视。Escherichia coli CICIM B0013-070是一株能同型发酵合成D-乳酸的基因重组菌。比较该菌株不同温度、不同供氧强度下的生长情况及发酵产酸性能。结果显示,采用微好氧发酵,在37、40℃温度下菌体量仍在增长;当发酵温度高于42℃后,菌体生长受到一定抑制,菌体量保持稳定,而乳酸的比合成速率和乳酸得率均有所提高。另外,对比微好氧发酵和限氧发酵的乳酸比合成速率发现,前者为后者的1.5～2倍;且微好氧条件下,葡萄糖到乳酸的得率随温度的提高逐渐增加,较高温度下接近甚至超过了限氧条件相同发酵温度下的得率。上述结果表明,在非严格限氧的条件下,可以通过发酵温度的提高,实现发酵阶段菌体生长和D-乳酸合成的代谢流微调,维持D-乳酸高生产强度的同时提高D-乳酸得率。     

高密度培养重组E-coli产胆固醇氧化酶的乳糖诱导策略

研究了乳糖诱导重组大肠杆菌表达胆固醇氧化酶。结果表明,乳糖不仅可以作为诱导剂诱导外源蛋白的合成,而且能作为碳源促进菌体的生长。通过对诱导条件的优化,实现了重组大肠杆菌的高密度培养,最高密度达68.9(OD600);在此基础上确定了最佳的诱导时机为发酵中期,菌体产酶水平达6005.66U/L,生产强度为200.19U/L.h,实现了胆固醇氧化酶的高效生产。     

重组大肠杆菌高效表达细胞外β-葡聚糖酶研究进展

β-葡聚糖酶是重要的工业用酶,对β-葡聚糖具有水解作用,能使其降解为低分子量片段,对酿造和饲料工业有重要意义.目前,国内对β-葡聚糖酶的研究还处于初级阶段,主要集中在构建基因工程菌株来提高酶的产量和性能方面,天然菌株的产酶量及酶的性能满足不了实际应用.结合近年来相关研究,从菌种选育、培养基优化以及发酵生产三个方面,总结介绍了重组大肠杆菌高效表达细胞外β-葡聚糖酶研究进展.     

重组凝乳酶原在大肠杆菌中的表达及活性研究

为了提高干酪生产中起重要凝乳作用的凝乳酶的原核表达效率,分析了Genbank中牛、羊和骆驼凝乳酶原(prochymosin,pCHY)的保守序列及大肠杆菌密码子的偏爱性,合成了凝乳酶原序列,并将其克隆至大肠杆菌原核表达载体上。经IPTG的诱导得到高效表达的凝乳酶原;Western blotting检测证明了其具有免疫原性;经pH值2到6活化后成功自剪切,得到大小约36 ku的有凝乳活性的凝乳酶。研究获得较高表达水平具有凝乳活性的重组凝乳酶。     

脉冲强光对大肠杆菌的杀菌作用

采用自主研制的脉冲强光杀菌装置,通过对大肠杆菌的杀菌试验,研究脉冲强光的杀菌影响因素.结果表明脉冲强光对大肠杆菌有明显的杀菌效果,各因素对脉冲强光杀菌效果影响的主次顺序是闪照次数＞光照强度＞菌液透光率＞菌液厚度.在光照强度0.5 J/cm2,菌液厚度3.4 mm,菌液透光率100,闪照16次能达到完全致死.此外,杀菌菌液的物理性质对杀菌效果有较大影响.     

大肠杆菌细胞膜固定相萃取辣木籽抗菌肽

制备大肠杆菌细胞膜固定相(E.coli cell membrane stationary phase,ECMSP),研究其对辣木籽抗菌肽的萃取效果。研究超声时间、超声功率对大肠杆菌破壁效果的影响,分析大肠杆菌细胞膜与大孔硅胶的吸附特征及ECMSP对辣木籽抗菌肽的吸附效果,明确萃取前后抑菌活力变化及反相-高效液相色谱（RP-HPLC）差异峰。结果表明：在超声功率500 W、超声时间30 min条件下,大肠杆菌破壁效果较好;大孔硅胶对大肠杆菌细胞膜的饱和吸附值（Csmax）为9.98 μg/mg、吸附常数（K*）为171.02 μg/mL;萃取前后抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果差异明显,RP-HPLC分析表明萃取前后出现了3个差异峰。研究结果可为辣木籽抗菌肽的后续开发利用提供理论基础和应用参考。     

维生素E用钯/炭催化剂的氢化

介绍用钯/炭催化剂催化氢化维生素E(VE)的方法,在反应温度100℃,反应压力0.8MPa,催化剂用量0.0025%(Pd/VE),反应2.5h的条件下,可获得碘值低于41g/100g的氢化维生素E。