莲子多酚氧化酶的分离与纯化

由多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）导致的酶促褐变严重影响莲子的外观。本研究旨在探讨莲子PPO的提取纯化方法,为研究其蛋白结构、进一步探究莲子褐变机理提供理论依据。以酶活力和酶比活力为指标,对比了提取PPO的四种方法,发现匀浆吸附后丙酮沉淀法提取莲子PPO可获得较高的酶比活力,达289.04 U/mg;采用单因素实验对该提取方法进行优化,得最佳提取参数为:料液比1∶5、提取时间2 h、p H=7、含2%PVPP和0.8%Triton X-100提取溶液,优化后PPO粗酶液酶比活力为294.40 U/mg;采用DEAE Sepharose Fast FLow阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶柱层析对粗酶液进行纯化,得到分子量大约为58 ku莲子PPO,酶比活力为7926.68 U/mg,纯化倍数为26.92,回收率为38.48%。      

荔枝果肉多酚氧化酶提取与初步纯化

酶促褐变是影响荔枝果肉加工和贮藏的重要问题,多酚氧化酶（PPO）是引起酶促褐变的重要酶类。用磷酸缓冲液匀浆提取荔枝果肉中的多酚氧化酶,提取液最佳离子浓度为0·1mol/L、最适pH为7·5、最佳提取时间为2h,最适料液比为1∶3。并通过硫酸铵沉淀和Phenyl Sepharose CL-4B（苯基琼脂糖CL-4B）疏水柱层析进行初步纯化,该酶被纯化了9·4倍,得率为48%。      

荔枝果肉多酚氧化酶提取与初步纯化

酶促褐变是影响荔枝果肉加工和贮藏的重要问题,多酚氧化酶(PPO)是引起酶促褐变的重要酶类.用磷酸缓冲液匀浆提取荔枝果肉中的多酚氧化酶,提取液最佳离子浓度为0.1mol/L、最适pH为7.5、最佳提取时间为2h,最适料液比为1:3.并通过硫酸铵沉淀和Phenyl Sepharowe CL-4B(苯基琼脂糖CL-4B)疏水柱层析进行初步纯化,该酶被纯化了9.4倍,得率为48%.     

小麦多酚氧化酶的分离纯化及酶学性质研究

为了减少多酚氧化酶(PPO)对产品所带来的负面影响,对从苏北红麦中提取的PPO粗提物进行分离纯化。经硫酸铵沉淀、DEAE阴离子交换层析和Superdex 200凝胶过滤层析,最终得到电泳纯化后只有一条条带的PPO,并对该纯化后的PPO进行酶学性质研究。试验结果为:纯化后PPO总酶活回收率为7.03%,纯化倍数22.35,比酶活为373.44 U/mg,电泳分析表明其相对分子质量约为30 000。测得其最适反应p H为6.5,最适反应温度为37℃;金属离子影响的研究表明,K~+、Na~+对其活性基本无影响,Ca~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)略有激活作用,Zn~(2+)、Cu2+激活作用较强;小麦PPO对邻苯二酚的K_m值为6.90 mmol/L,对焦性没食子酸(三酚类)、邻苯二酚(二酚类)底物亲和性较强,对单酚类(苯酚、愈创木酚)、二酚类(对苯二酚、间苯二酚)底物亲和性很低。     

丝瓜多酚氧化酶的分离纯化及酶学性质

从丝瓜中分离纯化出多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）,并对其部分酶学性质进行研究。采用硫酸铵分级盐析、透析、DEAE-Cellulose DE-52离子交换层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析分离纯化丝瓜PPO。纯化所得酶的比活力为957.9 U/mg,纯化倍数为28.3,酶活力回收率为18.5%;十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）检测结果显示该酶蛋白呈单一条带,为单亚基蛋白,其分子质量约为67.8 kD,且无同工酶;该酶最适pH6.0,最适温度30 ℃,以左旋多巴（L-dopa）为底物,其米氏常数（Km）为1.32 mmol/L,最大反应速率（Vmax）为0.22 OD475 nm/min。     

烟草多酚氧化酶的分离提纯及性质研究

本文用丙酮干粉,硫酸铵分级沉淀,阴离子交换层析,阳离子交换层析和凝胶过滤方法从新鲜的烟叶中分离纯化出了一种多酚氧化酶Ⅰ和多酚氧化酶Ⅱ(根据过DEAE-Sephadex A-50柱后的前后顺序,命名A-5柱先洗脱的活性组分为多酚氧化酶Ⅰ(PPOⅠ),后洗脱的为多酚氧化酶Ⅱ(PPOⅡ)).分离后多酚氧化酶Ⅰ的比活力是原来的71倍,而多酚氧化酶Ⅱ的比活力为原来的100倍.SDS-PAGE电泳显示分离所得的多酚氧化酶为纯品,其分子量分别为42kDa和42.5kDa.最后测量了分离得到的PPO的一些基本性质,结果表明多酚氧化酶Ⅰ在pH=7,t=40℃时具有最大活力,多酚氧化酶Ⅱ在pH=6,t=40℃时具有最大活力.动力学研究表明在pH=6.5,以邻苯二酚为底物的条件下,两种酶Km值分别为6.8mmol/L和1.2mmol/L.     

高灌蓝越橘多酚氧化酶的提取和纯化

采用丙酮粉沉淀抽滤法、硫酸铵分级沉淀法及苯基琼脂糖疏水性层析法对高灌蓝越橘多酚氧化酶进行提取和纯化。在提取和纯化中，用加入不同的酚吸收剂和抑制剂并比较酶活性的高低来确认最佳方法。结果表明在粗提中加入酚吸收剂、增溶剂和抑制剂提取效果较好，苯基琼脂糖疏水性层析法对此类酶纯化效果较佳并为后来的辅酶的分离提供了较高的纯化倍数。     

香菜叶多酚氧化酶的分离纯化与部分酶学性质研究

新鲜香菜叶经匀浆、缓冲液提取、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的多酚氧化酶。该酶比活力达到5 622.95 U/mg,酶活回收率为3.90%,纯化倍数为126.08;全酶分子质量为111.10 kD,亚基分子质量为55.60 kD;最适温度为37 ℃,最适pH值为6.5;在25～45 ℃及pH 6.0～7.0范围内有较好的稳定性;在最适条件下测得其Km值为4.04×10－2 mol/L;甲醇、乙醇、异丙醇、氯仿及柠檬酸、抗坏血酸、Ca2＋、Hg2＋、Ba2＋对其有抑制作用,Co2＋、Pb2＋对其具有一定的激活作用。     

澳洲青苹多酚氧化酶的分离纯化研究

采用丙酮粉沉淀抽滤法从澳洲青苹中提取多酚氧化酶.提取的粗酶液经30%～90%饱和度硫酸铵分级沉淀、透析除盐、交联葡聚糖G-75凝胶色谱层析、后经PEG 6000浓缩,得到纯化的多酚氧化酶,纯化倍数为7.49.纯化后的酶液经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,采用考马斯亮蓝R-250染色显示一条电泳带.通对过PPO与邻苯二酚反应产物的波谱扫描显示,其产物在λ=410nm下有最高吸收.     

植物基原料游离多酚的提取与分离纯化方法研究进展

多酚是植物基食品原料中的主要次级代谢产物, 具有多种生物活性与药用价值。植物基原料中的游离多酚结构具有多样性, 稳定性也存在差异, 在提取和分离纯化过程中, 由于技术局限或方法不当, 游离多酚易发生降解, 浸提率低、产品纯度低等问题一直是制约其深度开发与广泛应用的瓶颈。结合现代提取分离技术, 针对植物基原料中酚类物质的差异性, 选择个性化的精准提取方案将是一种有效的解决思路。本文总结了近5年游离多酚的提取和分离纯化方法的研究进展, 概述了植物基原料游离多酚的存在形式, 归纳了溶剂萃取等传统方法和超声波、微波、超临界流体等现代技术辅助提取法, 总结了金属离子沉淀、柱层析、吸附树脂、膜分离技术及高速逆流色谱法在分离纯化过程中的应用, 旨在为植物基原料中游离多酚的精准提取及活性物质的个性化开发和高值化应用提供参考。     

Prokaryotic expression and purification of Camellia sinensis polyphenol oxidase

BACKGROUND: Polyphenol oxidase (PPO) causes the postharvest loss of fruits and vegetables but is also a key factor in the quality development of tea. However, there are no reports on engineered active plant PPO purified from prokaryotic cells. RESULTS: In this study the ppo gene of about 1800 bp from Camellia sinensis cv. Yihongzao was successfully cloned and expressed in Escherichia coli. The PPOs purified from both the soluble fraction and the inclusion bodies showed activity. In addition, 1.0 × 10^?7 mol L^?1 Cu²⁺ and acidic conditions were found to be favourable for the engineered PPO catalysis of catechol oxidation. CONCLUSION: This paper represents the first report on C. sinensis ppo expression in E. coli and engineered active PPO purification. The results of the study provide a basis for the large‐scale preparation and application of PPO. Copyright © 2010 Society of Chemical Industry     

天然活性多酚提取、纯化及功能性研究进展

天然活性多酚系为具生理活性多酚类物质及其衍生物总称。现代研究表明,其具有多种生理功能和药物活性,在食品、医药、日用化工、精细化工等领域都有广泛应用。该文对天然活性多酚提取、纯化方法及其功能性研究进展进行综述。     

响应面法优化无核白葡萄多酚氧化酶的提取工艺

为了优化无核白葡萄多酚氧化酶的提取工艺。采用丙酮提取法、超声波辅助浸提法和缓冲溶液浸提法分别提取无核白葡萄多酚氧化酶,在单因素实验料液比、提取时间和缓冲液pH的基础上,利用响应面法优化无核白葡萄多酚氧化酶提取条件。结果表明,多酚氧化酶提取的最佳工艺为料液比1:1.8 (g/mL),浸提时间2.9 h,缓冲液pH5.8,无核白葡萄多酚氧化酶比活力为(378.12±1.3) U/mg,与模型预测值非常接近,拟合性好。采用响应面法分析,能较为准确的预测实验结果,以期为无核白葡萄多酚氧化酶纯化、性质、结构研究提供基础。     

苦杏仁多酚氧化酶的分离纯化及部分特性分析

以苦杏仁为原料,采用(NH4)2SO4分级沉淀法对苦杏仁多酚氧化酶进行初步分离后经Sephadex G-75凝胶柱层析进一步纯化,冷冻干燥后即得苦杏仁多酚氧化酶纯品;通过凝胶电泳和热分析试验测定多酚氧化酶的相对分子质量和变性温度。结果表明:经分离纯化后苦杏仁多酚氧化酶的纯化倍数为49.03倍,该酶可能存在同工酶且相对分子质量分别约为21.9 k D和23.2 k D;苦杏仁多酚氧化酶变性温度为60.03℃。为苦杏仁加工过程中的酶促褐变控制提供部分理论参数。     

Comparison of two treatment methods on the purification of shrimp polyphenol oxidase

The effects of different stirring time and two treatment methods (salt and organic solvent) on the recovery of shrimp polyphenol oxidase (PPO) were investigated. Stirring for 30 min yielded maximal PPO recovery. With respect to PPO specific activity, yield and purification fold enhancement, the use of butanol treatment followed by Phenyl Sepharose CL-4B chromatography was shown to be better than ammonium sulphate fractionation and then Phenyl Sepharose chromatography. White shrimp PPO was more susceptible than pink shrimp PPO to inactivation during purification. © 1997 SCI.     

龙井茶树多酚氧化酶蛋白提取方法的优化

目的优化缓冲液匀浆提取茶树多酚氧化酶的方法。方法以龙井43号茶树鲜叶为材料,采用缓冲液匀浆浸提法提取茶树多酚氧化酶,分别进行不同单因素浸提优化试验,测定比较提取的粗酶活性,确定适合的浸提条件。结果以鲜叶标准为一芽二叶,料液比1:2,加入内含5%PVP(w:v)、经预冷的p H5.6柠檬酸-磷酸盐缓冲液(0.15 mol/L),海砂适量,冰浴研磨,4℃条件下隔夜浸提12 h,于4℃、9000 r/min离心35 min,取上清液,为龙井43号鲜叶中多酚氧化酶缓冲液成浆浸提的最优条件。结论采用优化的浸提条件,可以制备得到高活性多酚氧化酶粗酶液,为茶树多酚氧化酶同工酶分离与酶性质研究提供了基础。     

肝素提取纯化技术研究进展

肝素是一类结构异常复杂的糖胺聚糖混合物,因具有多种生物学功能,其提取纯化方法一直是各国学者研究的热点。文章概述了肝素的结构特点及理化性质,对肝素提取纯化技术进行了综述,重点阐述了分离纯化技术的最新研究进展,包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析及毛细血管电泳等,展望了肝素未来的研究趋势。     

百合中多酚氧化酶的部分性质

通过丙酮酚法从百合中提取出多酚氧化酶(PPO)的粗酶液。以儿茶酚为底物时它有两个最适pH,分别为4.0、7.0,在pH5.0-6.5之间酶活力可以在4℃保持至少10h。PPO的最适温度为40℃,从40℃开始酶出现热失活,热失活速度符合一级反应动力学。PPO除对L-酪氨酸没有活力外,对儿茶酚、儿茶素、没食子酸均有活力,其中对儿茶素具有最好的底物特异性。亚硫酸钠对PPO的抑制作用最强,高浓度的抗坏血酸、半胱氨酸、硫脲也有很好的抑制作用,氯化钠、氯化钙、柠檬酸的抑制作用较差。