双孢蘑菇中AbbHLH的表达、纯化及多克隆抗体制备

碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）转录因子在真核生物中广泛存在,是数量较多的转录因子家族之一。该文首次克隆并鉴定双孢蘑菇中的一个AbbHLH（Agaricus bisporus basic helix-loop-helix）转录因子,建立原核表达载体pET-28a（+）-AbbHLH并将其转至E.coli BL21（DE3）感受态细胞中诱导表达,得到主要以包涵体形式存在的6×His-AbbHLH重组蛋白,经纯化与复性后得到纯度超过80%的抗原蛋白。用制备的抗原蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接酶联免疫吸附测定法测定结果表明抗体血清的效价可达102 400。将抗体血清依次经Protein A及CNBr亲和纯化后,用Western Blotting检测抗体特异性,结果表明该抗体能够特异性识别双孢蘑菇中的AbbHLH蛋白。     

鲫鱼MBSP的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

构建鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)的原核表达菌株Rosetta(pET28aMBSP),获得重组MBSP,以制备MBSP多克隆抗体。将鲫鱼MBSP全长基因(MBSP)借助表达载体pET-28a构建重组表达菌株Rosetta(pET28a-MBSP),并进行诱导表达后获得重组MBSP。利用Ni-NTA agarose亲和层析柱纯化重组蛋白并进行质谱鉴定。以纯化后的重组MBSP作为抗原免疫新西兰兔,获得MBSP多克隆抗体。分别采用ELISA和Western blot技术测定其效价和特异性。诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析、Western blot检测及质谱鉴定,结果表明该蛋白质为重组MBSP,其相对分子质量约为28×10~3,与天然MBSP大小一致,主要以包涵体形式存在。将其免疫兔子后,从血清中获得了与MBSP发生特异性反应的高效价多克隆抗体。本研究中成功表达和纯化了重组MBSP蛋白,制备了高效价的特异性MBSP多克隆抗体,为MBSP的相关研究奠定基础。     

阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶的原核表达及其多克隆抗体制备

以阪崎肠杆菌(ATCC29544)的基因组DNA为模板通过PCR扩增出α-葡萄糖苷酶基因malA,将其克隆入表达载体PET22b(+),构建重组表达质粒pET22b-malA将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),进行优化表达.采用尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,然后再免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.通过ELISA测定效价,并通过免疫荧光法鉴定与菌体表面结合能力结果表明克隆的目的基因全长1677bp,与Genebank的malA比较具有100％的同源性.带His标签的融合蛋白以包涵体形式表达,其最优化的表达条件是37℃下用0.8mmmol/L IPTG诱导5h.ELISA测定效价为5×105;免疫荧光法鉴定表明多克隆抗体能与阪崎肠杆菌表面结合.本实验为阪崎肠杆菌的免疫磁珠检测奠定了基础.     

阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶的原核表达及其多克隆抗体制备

以阪崎肠杆菌（ATCC29544）的基因组DNA为模板通过PCR扩增出α-葡萄糖苷酶基因malA,将其克隆入表达载体PET22b（+）,构建重组表达质粒pET22b-malA。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,进行优化表达。采用尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,然后再免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。通过ELISA测定效价,并通过免疫荧光法鉴定与菌体表面结合能力。结果表明克隆的目的基因全长1677bp,与Genebank的malA比较具有100%的同源性。带His标签的融合蛋白以包涵体形式表达,其最优化的表达条件是37℃下用0.8mmol/L IPTG诱导5h。ELISA测定效价为5×105;免疫荧光法鉴定表明多克隆抗体能与阪崎肠杆菌表面结合。本实验为阪崎肠杆菌的免疫磁珠检测奠定了基础。      

番茄乙烯信号转录因子LeERF1多克隆抗体制备及应用

为研究番茄乙烯信号转录因子LeERF1在蛋白水平的生化活性及生物学功能,通过免疫兔子制备了抗LeERF1多克隆抗体,抗体的效价大于10000.抗LeERF1多克隆抗体经DEAE-52离子交换柱纯化,纯度达到99%.纯化的抗LeERF1多克隆抗体具有免疫特异性.蛋白印迹试验结果表明,粉红期番茄果实中LeERF1蛋白含量与番茄青霉茵侵染有相关性.     

莱茵衣藻IFT25的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

IFT25是维持纤毛运动和感知所必须元件纤毛内运输蛋白IFT复合物B中的重要组分之一,探索IFT25尤其在模式生物莱茵衣藻中的作用机制具有重要作用。作者采用经济和简单的方法,制备莱茵衣藻IFT25的兔源多克隆抗体。将ift25分别连接到pMAL-c2X-和pET-28a(+)-载体上,转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导大量表达,并经亲和纯化后蛋白质纯度超过90%。通过颈背部皮下多次免疫8周龄大的新西兰大白兔,制备多克隆抗体,取第五次免疫后血清用ELISA测定效价超过128 000。抗血清依次经过Protein A和硝酸纤维素膜纯化后,用Western blotting检测抗体特异性,结果表明制备的抗体可以特异性识别莱茵衣藻中的IFT25,为IFT25作用机制的阐明和纤毛相关疾病的诊断提供了重要理论和方法支持。     

莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT57抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

IFT57是纤毛内运送蛋白IFT B复合物的一个重要组分,在鞭毛组装中发挥着重要作用。利用莱茵衣藻ift57基因中一段编码亲水性氨基酸序列的片段构建了带有6×His标签的原核表达载体pET-28a(+)-ift57,并转入大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达蛋白质,以12 g/dL SDS-PAGE鉴定,获得相对分子质量大小为17 200的ITF57重组蛋白质片段。对6×His-IFT57融合蛋白质进行纯化,并用其免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血液并分离血清。利用Western blotting对所获抗体进行特异性鉴定。ELISA测定结果表明,抗血清效价为512 000。在抗血清经Protein A纯化后,Western blotting检测显示所制备的IFT57多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻中的IFT57蛋白质。这一结果表明,为表达纯化溶解性较差的蛋白质抗体制备提供了借鉴意义,所获抗体为深入研究IFT57在鞭毛组装中的作用机理奠定了基础。     

苹果ACO1基因及转录因子MdHB-1基因的表达模式

研究苹果MdACO1基因及转录因子MdHB-1基因在不同器官和不同发育阶段的表达量及其对外源乙烯的反应,以期探讨两基因之间的可能关系。以苹果品种“皇家嘎拉”为试材,利用实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析不同器官和果实不同发育阶段基因的表达,以及乙烯利处理果实对基因表达的影响。在不同组织器官中,MdHB-1在花瓣中表达量较高,而MdACO1在成熟果中表达量较高。在果实不同发育阶段中MdHB-1在未成熟果中（盛花期40 d后）表达量最高,MdACO1在成熟果中尤其是花后100 d表达量最高。外源乙烯利（500 mg/L）处理的果实放置0～1 d时抑制MdHB-1的表达,但在7 d后其表达量增高;MdACO1表达量在外源乙烯利处理后迅速升高,并随着放置时间的延长而大幅度增高。转录因子MdHB-1可能参与了苹果幼嫩果实和花器官中其他相关基因表达的调控,这一过程似与MdACO1无关。MdACO1参与了果实的成熟过程,但并无受MdHB-1调控的迹象。外源乙烯会诱导成熟果实ACO1基因的过量表达,这一反馈调节过程似与MdHB-1无关。     

莱茵衣藻BBSome蛋白BBS2原核表达、纯化和多克隆抗体的制备及鉴定

BBSome蛋白复合物是纤毛蛋白组分之一,BBSome组装或纤毛运输缺陷可导致巴-比二氏综合征。其中,BBSome组分BBS2缺失已被临床证明是导致BBS的病因之一。莱茵衣藻是研究BBSome组装和纤毛运输的一种很好的模式生物。为深入研究BBS2的致病机制,需要特异性识别其BBS2蛋白的抗体。本文将莱茵衣藻BBS2 基因5''端399 bp的cDNA序列克隆到原核表达载体pET28a-bbs2,转入大肠杆菌 BL21（DE3）细胞进行诱导表达。在8 mol/L尿素存在的情况下对该融合蛋白进行镍柱亲和纯化,并将纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔。SDS-PAGE电泳结果表明：分子量为15 kDa的重组6×His-BBS2融合蛋白为水不溶性蛋白。5次免疫后的抗莱茵衣藻BBS2抗血清效价高达1∶256 000。经Protein A琼脂糖CL-4B亲和纯化后的抗血清不仅在Western blotting 分析中能特异性识别莱茵衣藻BBS2,而且在免疫荧光染色分析中能精确定位BBS2于基体和纤毛内。这一多克隆抗体的成功制备为深入开展 BBS2在BBSome组装和纤毛运输中的分子作用机制提供了基础。     

诺如病毒衣壳蛋白多克隆抗体的制备及效价分析

将大肠杆菌表达的GII-4型诺如病毒(Norovirus,NV)衣壳蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;收集抗血清,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测其效价,并对经聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction,PCR)验证为阳性的NV感染样品进行检测,比较两种检测方法的差异性。以原核表达的诺如病毒衣壳蛋白作为抗原制备的NV特异性多克隆抗体具有良好的免疫反应性,抗体效价为1∶10000,可以用于免疫学检测。     

抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的制备

为了制备赭曲霉毒素A多克隆抗体,采用戊二醛法合成赭曲霉毒素A-BSA人工抗原,通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白偶联效果.合成的人工抗原用弗氏佐剂乳化后免疫Balb/c小白鼠,4次免疫后眼球下缘采血,分离血清.试验结果表明,免疫后产生了抗赭曲霉毒素A-BSA的特异性多克隆抗体,抗体效价为1:8100,赭曲霉毒素A的最低...     

弧菌外膜蛋白Ompk基因序列分析及其多克隆抗体的制备

弧菌外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）OmpK不仅可激发机体的体液免疫和细胞免疫,而且可在不同血清型菌株之间产生免疫交叉反应。本研究利用克隆测序和查找GenBank获得20 株弧菌的Ompk基因序列并构建Ompk系统进化树,对比分析20 株弧菌Ompk基因序列;利用原核表达系统表达野生株Vibrio parahaemolyticus B的OmpK,纯化OmpK后制备兔多克隆抗体;采用酶联免疫吸附分析法和蛋白质印迹法（Western-blotting）分别检测抗体效价和特异性。系统进化树和基因序列比对结果显示Ompk基因在弧菌中高度保守,核苷酸序列相似性在77%以上;原核表达系统成功表达了弧菌OmpK,蛋白经纯化后成功制备的兔多抗效价达1∶16 000;Western-blotting实验证实抗体具有很好的特异性;OmpK多克隆抗体在弧菌中普遍存在免疫交叉性。因此,弧菌Ompk基因序列分析及其抗体研制,不仅为弧菌快速免疫学检测提供可能性,也为以OmpK为靶点的水产疫苗研制奠定了基础。     

莱茵衣藻IFT20的原核表达、纯化及多克隆抗体鉴定

莱茵衣藻鞭毛内运输（intraflagellar transport, IFT）蛋白IFT20是IFT蛋白复合物B（IFT-B）的组分之一。虽然IFT20参与调控细胞内大分子的胞内运输过程,但其作为一个鞭毛蛋白在鞭毛内的详细功能仍有待研究。为了开发高特异性的莱茵衣藻IFT20兔源多克隆抗体,作者首先在大肠杆菌中表达了N端6×His标签标记的IFT20融合蛋白（6×His::IFT20）,并对其进行镍柱纯化,将纯化所得6×His::IFT20蛋白免疫新西兰大白兔。采集3次免疫后的抗血清,利用间接ELISA法测定其效价为1∶102 400。利用protein A纯化珠对所得抗血清进行了IgG亚型抗体富集,接着用大肠杆菌表达纯化所得N端MBP标签标记的IFT20（MBP::IFT20）,并对IgG抗血清进行抗原抗体亲和纯化。经对CC-125藻种全细胞蛋白质提取物进行免疫印迹法鉴定,所得IFT20多克隆抗体特异性较高,适合用于后续莱茵衣藻IFT20鞭毛内运输功能的研究。     

展青霉素人工抗原及多克隆抗体的研制

采用戊二酸酐法合成展青霉素-半戊二酸（PAT-HG），通过活泼酯法将PAT-HG偶联到牛血清白蛋白，制备了展青霉素免疫抗原（PAT—HG—BSA），免疫3只BALB／c小鼠，经4次免疫后，1号小鼠血清抗展青霉索抗体效价迭1：1600，且小鼠抗展青霉素多克隆抗体与展青霉素检测抗原的结合能被展青霉素阻断。     

隐性孔雀石绿多克隆抗体的制备及鉴定

研究制备孔雀石绿(MG)代谢物隐性孔雀石绿(LMG)多克隆抗体进而间接鉴定鱼体中孔雀石绿的残留。首先利用化学方法合成含羧基的隐性孔雀石绿衍生物(CLMG),然后采用碳化二亚胺法偶联牛血清白蛋白(BSA)合成免疫抗原隐性孔雀石绿-BSA,按照常规免疫程序免疫新西兰大白兔制备抗隐性孔雀石绿多克隆抗体。采用间接酶联免疫吸附实验(iELISA)测定抗血清中抗隐性孔雀石绿多克隆抗体效价。结果表明：抗隐性孔雀石绿的抗体效价为1: 32000,可用于隐性孔雀石绿的免疫学检测。     

庆大霉素人工抗原及多克隆抗体的制备与鉴定

为研究建立庆大霉素的免疫分析技术,合成庆大霉素人工抗原:采用碳二亚胺法将庆大霉素(gentamicin,GM)偶联到牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)上,分别合成免疫原GM-BSA和包被原GM-OVA。通过紫外扫描和SDS-PAGE垂直电泳鉴定证明人工抗原偶联成功。以GM-BSA为免疫原,采用新的动物免疫方案免疫新西兰大白兔,获得抗庆大霉素抗血清。在本次免疫新方案中,在动物的生命周期内获得了多于普通免疫的血清量,在多抗血清的制备上是一次抗体工程上的尝试。通过间接酶联免疫对抗血清效价和灵敏度进行跟踪检测,结果表明抗血清效价在九免后稳定在1:20000左右,IC50则稳定在3 ng/mL左右。并在八免血清基础上建立了GM间接竞争ELISA法。结果表明,庆大霉素浓度在0.3~243 ng/mL,方法的线性回归方程为y=-0.1009lnx+0.6093和R2=0.9845,方法的检测灵敏度IC50=2.954 ng/mL,最低检测限IC10=0.056 ng/mL。该研究结果为多抗血清制备在量上的突破提供了思路,同时为研制庆大霉素试剂盒提供了良好的基础。