DGGE技术及其在食品微生物研究中应用

变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术是一种分析微生物区系分子指纹技术,具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点,已被广泛应用于微生物分子生态学领域研究。该文对DGGE技术基本原理及其在食品微生物中多样性分析、食品微生物动态监测、快速检测等应用进行综述,并对该技术局限性和应用前景进行评述。     

PCR-DGGE技术在应用过程中的常见问题分析

PCR-DGGE指纹分析技术近来被引入到食品微生物的研究中,作为一项分子手段在食品微生态领域的广泛应用显示了它在分析复杂微生物区系遗传多样性和监控种群动态性方面独特的优越性。文中结合近10年相关文献对PCR-DGGE技术使用中存在的问题进行了综述,包括菌种鉴定、扩增区域的选择和电泳条件的优化3个方面,另外还讨论了其在今后应用中的潜力及前景。     

应用DGGE方法构建健康人粪便乳杆菌标准指纹图谱

从健康人的新鲜粪便样品中分离乳杆菌,鉴定属种后构建一种能够快速鉴定未知属种乳杆菌的标准指纹图谱.首先通过形态学观察及K2O2酶等生理生化试验对所分得菌株进行初步鉴定,然后利用16S rDNA序列同源性分析方法,对所分得菌株进行16S rDNA基因扩增与测序,测序结果与GenBank中该属内茵株的16S rDNA基因序列进行同源性分析,从而准确鉴定所分得菌株.最后,利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法构建标准指纹图谱.结果表明,从健康人新鲜粪便中分离得到8株乳杆茵,经鉴定,其中4株为植物乳杆菌,1株为卷曲乳杆菌,3株为发酵乳杆菌.所得标准指纹图谱中试验菌株大体被分成4类,与16S rDNA基因序列同源性分析结果相吻合.通过传统方法可以从健康成人的新鲜粪便中分离得到乳杆菌,传统方法与分子生物学方法相结合可以将其准确鉴定到种的水平.变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法可以在种的水平上作为快速鉴定乳杆菌的一种有效工具.     

黄酒酿造过程细菌群落结构变化初步研究

应用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术对黄酒酿造过程细菌群落的结构变化进行分析研究。以细菌通用引物扩增16SrDNA基因V3高变异区,扩增产物进行DGGE,获得表征细菌群落结构的指纹图谱。分析结果表明,浸米水、麦曲和酒母的细菌群落结构各不相同,其中麦曲的细菌群落多样性较为丰富;前酵和后酵阶段细菌群落结构存在差异,同一阶段细菌群落结构组成类似。测序结果显示,存在于黄酒酿造过程中的细菌主要有乳杆菌（Lactobacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）、布丘氏菌（Buttiauxella）等种类,同时,黄酒酿造过程中还存在着不可培养（Uncultured bacterium）的优势细菌。PCR-DGGE技术是研究黄酒酿造过程细菌群落结构变化的一种有效手段。      

基于DGGE和Illumina MiSeq技术解析恩施地区米酒细菌多样性

以10个恩施地区米酒为研究对象,采用变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)与MiSeq高通量技术对其细菌多样性进行了评价。DGGE结果表明,恩施地区米酒中的细菌主要为Weissella、Enterococcus、Pediococcus、Kosakonia和Lactobacillus。MiSeq高通量测序结果表明,米酒中的细菌属主要为隶属于Firmicutes的Pediococcus、Enterococcus、Weissella,以及隶属于Proteobacteria的Kosakonia和隶属于Bacteroidetes的Prevotella,其平均相对含量分别为58. 03%、10. 72%、8. 24%、3. 34%和2. 01%。在分类操作单元(operational taxonomic units,OTU)水平上,发现了6个核心OTU,其中OTU5646 (隶属于Pediococcus)的平均含量为54. 74%。采用传统纯培养技术共分离出17株乳酸菌,其中11株鉴定为Pediococcus pentosaceus。由此可见,Pediococcus为恩施地区米酒样品中的优势细菌。     

应用PCR-DGGE技术分析不同性状窖泥的细菌群落结构

基于聚合酶链式反应-变性梯度凝胶（PCR-DGGE）技术分析了不同性状窖泥的细菌群落DGGE指纹图谱,结果表明,通过DGGE指纹图谱能够区分新窖泥、窖壁泥和窖底泥,其中以窖壁泥退化前后图谱变化最明显。PCR-DGGE图谱优势条带测序结果显示,窖泥中细菌微生物包括拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、变形菌门4类,其中新窖泥微生物种类最丰富,涵盖以上门类,特有优势微生物为Enterobacterale科、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）及里氏杆菌属（Riemerella）。紫单孢菌科（Porphyromonadaceae）仅存在于窖底泥中,Tumebacillus属微生物只存在于窑壁泥中。通过窖泥的DGGE图谱对比分析,能够对窖泥类型做出初步判定,并能及时发现窖泥退化现象,为工厂窖泥培养、检测和窖泥优化提供了理论支持。     

变性梯度凝胶电泳技术在食源性沙门氏菌分子分型中的应用研究

目的建立基于变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术的沙门氏菌分型方法。方法以5株代表性沙门氏菌为供试菌,用引物对GC-rpoB1/ropB3R扩增获得目的片段后,经变性凝胶电泳分离获得谱图,量化分析谱带多样性及均一性,依据菌株谱图量化相似性构建聚类分析图,分析该技术用于沙门氏菌分型的可行性。结果 5个供试菌的PCR-DGGE谱图差异大,其中以标准菌株肠炎沙门氏菌(ATCC9184)的多样性及丰富度最高,标准菌株鼠伤寒沙门氏菌的最低;就谱带相似性而言,分离自鸭腿样品的2株沙门氏菌的相似性最高,戴斯系数高达85.7%,而分属于不同血清型的两个标准菌株则相似度指数为0%;基于谱带相似性建立的聚类树可将供试菌株很好地分为不同簇。结论本研究所建立的基于PCR-DGGE技术的沙门氏菌分型方法准确度和分辨力均较理想,具有一定的理论及实际意义。     

温度对储藏玉米中霉菌生长影响的动力学模型构建

以储藏玉米中霉菌为研究对象,用修正的Gompertz方程拟合腐败霉菌分别在不同储藏温度、不同时间条件下的生长动力学模型,采用修正的线性Arrhenius-Davey方程建立二级模型,模拟温度对玉米中霉菌生长的比生长速率和迟滞期的影响。对构建模型的有效性分别进行了验证,模型的R~2较高,分别为0.959和0.994,偏离因子分别为0.951和0.927,精确因子都小于1.082,均方差值(0.009~0.027)也较小。表明所构建的线性Arrhenius-Davey模型能较好地描述、预测不同温度对玉米中霉菌的比生长速率和迟滞期的影响。     

霉菌及霉菌毒素对玉米的危害及防控对策和建议

霉菌及霉菌毒素污染粮食后,降低了粮食的使用价值,影响其食用安全性,危及使用者的健康。主要阐述了霉菌及其霉菌毒素的特点、玉米受其污染的现状及预防的对策和建议。     

主要粮食品种储藏期间霉菌活动特性研究

研究了稻谷、玉米和小麦在25℃,相对湿度分别为75%、85%和95%储藏,以及在高于安全水分2%的相似水活度条件下储藏期间霉菌的活动特性.结果表明,小麦最易出现霉菌生长活动,稻谷的抗霉菌生长作用最强,玉米介于小麦和稻谷之间;其中85%相对湿度下储藏至28 d,小麦的微生物活性值升高了475 u,分别是稻谷和玉米同期升高值的5.6和3.5倍.储粮中霉菌活动特性的不同表现与各粮种的吸湿性能及粮粒外皮(颖壳或种皮)的霉菌可生长性差异有关,但将相同霉菌活动强度的储粮样品作相关品质指标的检测,发现小麦的黏度、发芽率变化不明显,而玉米和稻谷的脂肪酸值和发芽率则有较大的变化.因此,对于储藏品质较稳定但易滋长霉菌的小麦应该重点关注霉菌活动的状况,仅仅监测品质指标变化难以准确判断储藏的安全性和粮食相关的食品安全性.     

变性梯度凝胶电泳技术及其在食品微生物研究中的应用

食品中的很多微生物无法分离培养,传统的微生物研究方法不仅费时费力,而且会造成偏差。变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)是一种不依赖于纯培养的分子技术,因其快速、灵敏、分析全面等特点已被广泛应用于微生物生态学的研究中。本文介绍了DGGE 的发展历程、原理、操作步骤及其在食品微生物研究中的进展,评价了该技术的优势和局限性,展望了其在食品领域内的应用前景。     

变性梯度凝胶电泳法初步解析茯砖茶渥堆发酵过程中细菌群落结构

为解析茯砖茶渥堆发酵过程中细菌群落结构和种类,对渥堆过程中不同时间段细菌16S rDNA 的V3可变区进行扩增,对细菌变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）图谱中条带进行克隆、测序和序列比对。结果表明：黑毛茶在渥堆过程中以渥堆24 h为分界点,前后各自细菌群落结构相似,但前后的差异较大;从16S rDNA 的V3可变区比对结果证明黑毛茶渥堆过程中有诺卡氏菌属、新鞘脂菌属、短波单胞菌属、韦龙氏假单胞菌属、突那梭菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属及不可培养的ε-变形菌、腐败螺旋菌属、黏球菌属、根瘤菌属和未知分类地位的不可培养细菌6 种。采用DGGE指纹图谱能更全面、更真实地反映黑毛茶渥堆发酵过程中细菌群落的结构和多样性变化。     

豉香型白酒酒饼中细菌PCR-DGGE分析方法的建立

本研究以豉香型白酒酒饼中的细菌类群为对象,针对PCR-DGGE分析方法中DNA提取、PCR扩增、DGGE电泳时间和凝胶染色方法等重要环节开展了相关技术参数的比较和优化。结果显示:试剂盒法、CTAB法、SDS法和SDS-CTAB结合法等四种DNA提取方法中,SDS-CTAB结合法提取的DNA得率最高,蛋白质去除干净,完整性好,虽然步骤稍繁琐,但优于其他方法;经均匀设计法优化后,PCR反应中退火温度为50℃,引物浓度为0.4μmol/L,模板2.5μL(约34 ng)时所扩增出的条带最清晰、产物量最高,对应的DGGE分析中DNA条带的多样度和丰度最佳;以进程法比较了不同时长的DGGE电泳效果,发现在变性剂梯度范围为30%~60%、电压85 V、温度60℃条件下,电泳9 h DGGE胶中的DNA条带分离充分,分布位置适中;同时还发现,利用银染色法对胶进行染色,效果优于Goldview染色法。综合上述因素,初步建立了豉香型白酒酒饼微生物PCR-DGGE技术的分析方法。     

Culture‐Based and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Analysis of the Bacterial Community from Chungkookjang,a Traditional Korean Fermented Soybean Food

Abstract: The bacterial community of Chungkookjang and raw rice‐straw collected from various areas in South Korea was investigated using both culture‐dependent and culture‐independent methods. Pure cultures were isolated from Chungkookjang and raw rice‐straw on tryptic soy agar plates with 72 to 121 colonies and identified by 16S rDNA gene sequence analysis, respectively. The traditional culture‐based method and denaturing gradient gel electrophoresis analysis of PCR‐amplified 16S rDNA confirmed that Pantoea agglomerans and B. subtilis were identified as predominant in the raw rice‐straw and Chungkookjang, respectively, from Iljuk district of Gyeonggi province, P. ananatis and B. licheniformis were identified as predominant in the raw rice‐straw and Chungkookjang from Wonju district of Gangwon province, and Microbacterium sp. and B. licheniformis were identified as predominant in the raw rice‐straw and Chungkookjang from Sunchang district of Jeolla province. Other strains, such as Bacillus, Enterococcus, Pseudomonas, Rhodococcus, and uncultured bacteria were also present in raw rice‐straw and Chungkookjang. Practical Application: A comprehensive analysis of these microorganisms would provide a more detailed understanding of the biologically active components of Chungkookjang and help improve its quality. Polymerase chain reaction‐denaturing gradient gel electrophoresis analysis can be successfully applied to a fermented food to detect unculturable or more species than the culture‐dependent method. This technique is an effective and convenient culture‐independent method for studying the bacterial community in Chungkookjang. In this study, the bacterial community of Chungkookjang collected from various areas in South Korea was investigated using both culture‐dependent and culture‐independent methods.     

新疆柯尔克孜族传统发酵饮料博扎中微生物群落结构的PCR-DGGE分析

采用PCR-DGGE 技术分析新疆柯尔克孜民族古老传统发酵饮料--博扎(Bozaa)中微生物种群结构,对博扎细菌和酵母菌DGGE 图谱上主要条带的DNA 进行测序和序列分析。结果表明,博扎中细菌组成包括植物乳杆菌(Lactobacterium plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巴氏醋酸杆菌(Acetobacerpasteurianus)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),初步成功解析评估了博扎中微生物的多样性。     

永川毛霉型豆豉在发酵过程中微生物总量与区系变化规律

采用巢式聚合酶链式反应配合变性梯度凝胶电泳技术对永川豆豉发酵过程中微生物区系生态演化进行解析。结果表明：永川豆豉在制曲过程中霉菌和细菌呈对数增长,进入后发酵阶段菌落总数快速下降,并保持在较低水平。永川豆豉在制曲前期有多种乳酸菌生长,后期乳酸菌受霉菌增长抑制,种类减少。在后发酵阶段奥德赛芽孢杆菌（Bacillus odysseyi）、乳酸杆菌（Lactobacillus oligofermentans）和乳酸杆菌（Lactobacillus lindneri）是优势菌群。同时在制曲初期也发现了费格森埃希菌（Escherichia fergusonii）等杂菌生长。永川豆豉制曲阶段优势霉菌是总状毛霉（Mucor racemosus）,同时伴有有性根霉（Rhizopus sexualis）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、大孢联轭霉（Syzygites megalocarpus）、米根霉（Rhizopus oryzae）的生长,后发酵阶段有接合酵母（Zygosaccharomyces sp.）的参与。     

冷藏带鱼贮藏期间主要微生物动态变化的PCR-DGGE分析

本文研究了冷藏带鱼贮藏期间的主要微生物种群演替规律,为延长水产品货架期提供参考。采用SDS化学裂解法,从冷藏带鱼中提取总细菌基因组DNA,并进行16SrRNA的V3可变区PCR扩增,再通过DGGE得到动态指纹图谱。结果表明,贮藏初期冷藏带鱼样品中的微生物群落丰富,嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.)为前期的主要优势菌。随着贮藏时间的延长,仅有少数种类细菌存活并最终成为主导菌群。荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)在贮藏过程中比例逐渐增大,希瓦氏菌(Shewanella sp.)与弧菌(Vibrio sp.)比例也有明显增加,在贮藏后期发展成为优势腐败菌。