基于TaqMan实时荧光PCR检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分

根据出入境检验检疫行业标准SN/T 3730.4—2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第4部分：驴 成分检测 实时荧光PCR法》合成引物和探针,利用TaqMan实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分。首先对13 种不同动物鲜肉组织的DNA进行驴源性成分特异 性检测,然后对驴源性DNA模板原液进行梯度稀释,检测方法灵敏度,最后在加工肉制品中检测方法的适用性。 结果表明：本研究建立的方法特异性强,除驴肉外,牛、羊、猪、马、骆驼、鹿、狗、兔、鸡、鸭、鸽子、鹌鹑 12 种动物鲜肉组织均无特异性扩增;方法的灵敏度较高,驴组分DNA的检出限可达100 fg/μL,灵敏度可达0.01%; 方法的适用性较广,可以用于加工肉制品中驴源性成分的检测。     

网销市场中驴肉真伪及掺假分析

目的为了保障食品安全和维护消费者合法权益,对网销市场中驴肉(鲜肉和制品)真伪及掺假情况进行分析。方法本研究根据现行行业标准SN/T 3730.4-2013和SN/T 3730.5-2013,分析市场中鲜驴肉(9份)和加工驴肉制品(18份)中的驴源性及马源性。结果 9份鲜肉样品中有4份为驴肉,剩余5份为马肉;加工肉制品中,7份含有驴源性成分,5份含有马源性成分,剩余6份既含有驴源性成分又含有马源性成分。结论市场中存在利用马肉冒充驴肉的欺诈现象,相关部门应加强监管,避免欧洲"马肉风波"在中国上演。     

食品中马源性成分定性检测能力验证结果与分析

摘要：目的提高实验室对食品中马源性成分定性鉴定的准确性和评估检测人员的专业技术水平,增强实验室竞争力。方法 通过核酸蛋白仪器分析法和单重实时荧光PCR法对样品真核生物18S rRNA基因扩增的循环阈值来分析DNA的提取质量。在利用标准SN/T 3730.5-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第5部分：马成分检测实时荧光PCR法》检测过程中,对该标准扩增体系的引物探针浓度进行优化和检出限分析后,用优化的扩增体系对样品进行检测。再依据标准SB/T 10923-2012《肉与肉制品中动物源性成分的测定实时荧光PCR法》的要求,对样品进行检测。最后对2个标准的检测结果进行比对。结果 提取的DNA质量符合标准要求。标准SN/T 3730.5-2013的引物探针浓度优化后,能有效扩增阳性样品,检出限为0.1%,能有效检测马源性成分。2个标准检测20-M805和20-Q719待测样品,均未检出马源性成分。结论 本次能力验证获得满意评价。DNA提取质量的评估,反应体系中引物探针浓度的优化与选择,不同检测方法结果的相互验证和实验的质量控制都是影响能力验证结果的重要因素     

SN/T 2980-2011在动物源性成分检测中的适用性分析

目的 探讨行业标准SN/T 2980-2011《动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法》在动物源性成分检测中的适用性。方法 基于中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2980-2011和国家标准GB/T 25165-2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法》对鲜肉组织及加工肉制品进行动物源性成分检测实验, 建立依托上述标准的动物源性成分检测能力。结果 SN/T 2980-2011中牛源性成分检测特异性不佳, 山羊源性成分检测特异性良好, 绵羊探针仅适用于单通道实时荧光PCR检测; GB/T 25165-2010中的牛、羊源性成分检测均展示出良好的特异性。结论 建议SN/T 2980-2011行业标准的起草单位及起草人重新设计适用于三重实时荧光PCR的牛、绵羊引物及探针,既要保证引物和探针的特异性也要保证适用性。     

基于便携式荧光定量PCR仪定量检测驴肉中掺假鸭肉

为建立快速方便的驴肉制品分子鉴定方法,本文以驴肉和常见的掺假肉类(鸭肉)为研究对象,筛选特异性引物和TaqMan探针,利用便携式Mini8 Plus实时荧光定量PCR仪进行灵敏度和特异性实验,通过绘制扩增标准曲线及确定驴肉和鸭肉的质量与DNA比值常数,对不同掺入比例(加入定量的鸭肉制成含量分别为20%、40%、60%、80%)的模拟样品和实际驴肉样品进行检测。结果显示,该方法对驴、鸭肉均具有良好的特异性,可以与马、猪、山羊、梅花鹿、牛、鸡、狗肉明显区分;对驴源性DNA成分的检出限为0.01 ng/μL,鸭源性DNA成分的检出限为0.1 ng/μL,对驴肉与鸭肉混合物中鸭肉成分的灵敏度为0.1%(w/w);所建立的标准曲线线性关系良好,驴肉DNA扩增标准曲线:y=-3.584x+27.003,R²=0.9982;鸭肉DNA扩增标准曲线:y=-3.538x+30.907,R²=0.9991;采用已建立的方法对35份驴肉样本进行市场试点调查,发现6份(17.1%)驴肉样本中含有鸭肉成分。以上研究结果说明,该实时荧光定量PCR方法可用于驴肉产品中其他...     

利用实时荧光定量PCR法检测食品中鹌鹑源性成分

为建立基于TaqMan实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术在食品中的鹌鹑源性成分的定量检测方法,根据现行检验检疫标准(SN/T 2727-2010)合成引物及探针。首先对13种不同动物鲜肉组织的DNA进行鹌鹑源性成分特异性检测,然后对鹌鹑源性DNA模板原液进行梯度稀释,检测方法灵敏度,最后在加工制品中检测方法的适用性。研究结果表明:建立的方法特异性强,除鹌鹑肉外,牛、羊、猪、马、驴、狗、兔子、鸡、鸭、鸽子、火鸡、鱼12种动物鲜肉组织均无特异性扩增;方法的灵敏度较高,鹌鹑组分DNA的检出限可达10 fg/mL,灵敏度可达0.001%;方法的适用性较广,可以用于加工制品中鹌鹑源性成分的检测。     

4种动物源性成分多重real-time PCR检测方法的建立及其在驴肉制品检测中的应用

建立一种同时快速检测驴、马、猪及鸭源性成分的四重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。分别以4种源性成分的Nad5、ATpase6、ATP8、cytb基因为靶基因设计特异性引物和Taq Man探针,以18S r RNA基因为内参基因,建立多重real-time PCR方法,并对该方法进行方法学验证,同时对不同掺入比例模拟样品、不同加工工艺模拟样品和实际驴肉样品进行检测。结果显示,该方法具有高通量、特异性强、灵敏度高等优点。当Ct值≤35.0时,方法对16种非目标源性具有良好特异性;灵敏度可检测到质量浓度为2×10^-4 ng/μL的模板DNA;对生肉的检出限为肉含量的0.001%,对熟肉制品的检出限为肉含量的0.01%;对100份实际样品进行检测,结果与标准方法一致,说明建立的多重real-time PCR法可用于肉及肉制品中常见掺假源性成分的检测。     

肉制品中鸭源性成分TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

目的 建立TaqMan探针实时荧光PCR法快速检测肉制品中鸭源性成分的分析方法。方法 以鸭生长激素(growth hormone, GH)基因为靶基因, 基于特异性保守序列设计引物和TaqMan探针, 优化反应体系和反应条件, 建立了鸭源性成分实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。结果 所建立的real-time PCR方法特异性强, 仅对鸭基因组DNA出现特异性扩增曲线, 对牛、羊、猪等其他异源性动物基因组DNA均无扩增曲线; 灵敏性高, 以鸭基因组DNA为模板, 检出限为1.0 pg; 重复性好, 不同浓度基因组DNA测定的Ct值变异系数小于4%。使用建立的real-time PCR方法对200份市售肉制品进行检测, 在11份肉制品中检出鸭源性成分, 同现行行业标准SN/T 3731.5—2013检测结果一致。结论 本研究所建立的real-time PCR方法检测具有特异性强、敏感性高、快速高效等特点, 适用于肉制品中鸭源性成分快速检测。     

阿胶中马和驴成分的实时荧光PCR检测

建立阿胶中马和驴成分高特异、高灵敏的实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检 测方法。选择马和驴线粒体基因tRNA-Thr及D-loop区为靶序列,设计合成特异引物,通过普通PCR和实时荧光PCR 检测,结果表明,这两对引物能够准确检测阿胶或动物胶中马和驴成分。     

鸭肉冒充牛羊肉的分子生物学检测

针对送检牛肉和羊肉样品,设计合成检测动物源性成分的通用引物,并对PCR产物测序后在NCBI数据库中进行比对;根据牛、羊、鸭源性成分检测的相关标准,合成引物和探针,进行送检样品中牛、羊和鸭源性成分的实时荧光PCR检测.结果表明:在7份送检样品中4份检测到鸭源性成分,2份检测到牛源性成分,1份检测到羊源性成分.实时荧光PCR方法灵敏性更高、特异性更强、结果判定更为迅速.     

基于双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术的核酸杂交试纸条快速检测驴肉中的马源性成分

目的：建立快速、操作简单、价格相对低廉的驴肉中马源性成分快速可视化检测技术。方法：采用双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术(RPA)与核酸杂交试纸条相结合。针对马线粒体细胞色素b(cytb)基因设计RPA引物,引物包含3个功能区域,特异性绑定区域用于RPA扩增反应,spacer 9用于终止聚合酶的扩增,单链拖尾区域用于与试纸条上的探针杂交。这对特殊引物使RPA扩增子带有两个单链拖尾序列,这两个单链拖尾序列可以特异性地被金纳米探针和试纸条上的检测探针识别并捕获,形成一条肉眼可见的红色条带。整个扩增(15 min)和检测(5 min)过程在20 min即可完成,无需复杂的设备,仅需要一台数字化水浴锅。为进一步验证该方法的实际应用性能,对市面上的20份驴肉产品进行测定,并采用PCR(Polymerase Chain Reaction,PCR)结合琼脂糖凝胶电泳的方法进行验证。结果：该方法对马肉的检测限达到0.01%,且仅对马肉核酸有特异性扩增,与其他8个物种的核酸均无交叉反应,20份驴肉样品中有2份存在马源性成分。结论：该方法特异性强、灵敏度高,可实现驴肉中马源性成分的可视化快速检测。     

COI序列应用于羊肉掺伪非定向筛查技术的研究

本项目研究了应用COI序列对羊肉中掺入的其他动物源材料进行非定向筛查,并对山羊肉及绵羊肉进行分辨。利用了DNA条形码技术对六个羊品种(系)的线粒体基因组细胞色素酶基因片段进行引物筛选,并利用筛选出的引物对七种动物源样本的COI片段进行扩增,以确定所筛选出的引物是否能将羊肉与其他动物源样品进行有效区分。以LCOI490/HCO2198、F1-1/R1-1、ITS3/ITS4为引物,通过对36份血液样本(山羊3个品种,绵羊3个品种)的基因组DNA进行PCR扩增,其中以F1-1/R1-1为引物得到的PCR产物电泳检测条带清晰,结果重现性好;利用F1-1/R1-1引物对鸡肉、猪肉、驴肉、牛肉、莱芜黑山羊肉、洼地绵羊肉和鸭肉等七种样本的COI片段进行扩增,并对扩增片段进行测序,山羊、绵羊之间的序列同源性仅为36.62%,其他各品种间的序列差异也很明显。结果表明:以F1-1/R1-1为专用引物可以有效区分羊肉与其他动物源样品,并能够对山羊肉及绵羊肉样品进行有效区别。     

可视化跨越式滚环等温扩增技术在猪肉掺假检测中的应用

目的:建立了一种跨越式等温扩增技术(SRCA)结合荧光染料SYBR Green I检测肉制品中猪肉掺假的方法。方法:根据NCBI中猪的线粒体序列,通过DNAMAN等软件设计SRCA的特异性引物,分别采用普通SRCA和荧光可视化SRCA的方法建立肉制品中猪肉成分的检测方法,对9个不同物种的新鲜肌肉组织样本进行实验从而验证SRCA方法的特异性,并对66份未标识猪肉成分商业肉制品进行猪肉成分的检测。结果:SRCA荧光可视法检测猪肉DNA的灵敏度为6.5 fg/μL,与传统PCR方法相比,SRCA荧光可视法的灵敏度提高了1000倍。在人工添加猪肉的混合样品中,SRCA方法检测猪肉含量为0.01%(w/w)。与NY/T 3309-2018行业标准相比,SRCA方法检测肉制品中猪肉的敏感性、特异性和符合率分别为100%、96.66%、98.48%。结论:SRCA是一种检测肉制品中猪肉掺假的灵敏、直观的方法,具有很大的应用潜力。     

一例沙门氏菌测量审核的回顾与分析

目的通过测量审核提升本实验室检测沙门氏菌能力与自身竞争力。方法以测量审核作业指导书、出入境检验检疫行业标准SN/T1869-2007食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法和国家标准GB4789.4-2016食品微生物学检验沙门氏菌检验为依据,采用PCR方法和传统增菌、分离、生化反应、血清学法鉴定沙门氏菌。结果编号091样品检出沙门氏菌,编号123样品PCR检测出现假阳性,经生化鉴定证实检出非沙门氏菌。结论 PCR出现假阳性,需经生化鉴定予以确认。本次测量审核样本检测结果与制样单位反馈结果一致。     

肉制品中牛源性成分多重实时荧光PCR检测 方法的建立及初步应用

目的建立肉制品中牛源性成分的荧光PCR检测方法。方法根据牛特异性线粒体DNA片段,设计合成两对引物,以生、熟牛肉及超市牛肉加工品为材料,建立肉制品中牛源性成分的多重实时荧光PCR检测方法,并用该法与国标法同时对市售的25份肉制品同时进行检测,通过对其他种类的肉源DNA进行扩增验证方法的特异性;对含有不同比例牛肉成分的DNA样本进行检测确定检出限。结果该方法可成功检测出肉制品中的牛源性成分。在25份肉制品检测中,与国标法检测结果一致。该法的特异性为100%,灵敏度检测线为1%。结论本研究成功建立牛源性肉制品的检测方法,该方法快速简便,且具有较高的特异性和灵敏度,可用于市售肉制品中牛源性成分的鉴定。     

PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages

A species-specific PCR assay was developed for the detection of low levels of pork, horse and donkey meat in cooked sausages. Oligonucleotid primers were designed for amplification of species-specific mitochondrial DNA sequences of each species and detected the presence of 0.01 ng of template DNA in water. When applying the assay to DNA extracts from sausages samples that were prepared from binary meat mixtures, it was possible to detect each species when spiked in any other species at the 0.1% level. In conclusion, it can be suggested that this assay can be used to determine mislabelled and/or fraudulent species substitution in comminuted meat products.