核桃谷蛋白抗菌肽的分离纯化及抑菌稳定性分析

目的：以核桃粕谷蛋白为原料生产抗菌肽,研发一种新型抗生素的替代品。方法：通过菌酶协同固态发酵法（枯草芽孢杆菌和碱性蛋白酶协同）从核桃粕谷蛋白中制备抗菌肽,通过超滤、凝胶层析过滤、液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）和分子对接对核桃粕谷蛋白抗菌肽（walnut glutelin antimicrobialpeptide,WGP）进行分离、纯化和筛选。以对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性保持率为指标,研究抗菌肽的抑菌稳定性。结果：经超滤、凝胶层析分离后,WGP-ⅢA和WGP-ⅢC组分均具有较强抗菌活性;LC-MS/MS结合虚拟筛选,从2种组分中共鉴定得到6条多肽,分子对接筛选得到3个肽段,分别为WGP-ⅢA组分的LAEAYNIPDTIARRL和WGP-ⅢC组分的SHSVIYVIR、APQLLYIVK;分子对接结果显示,WGP-ⅢC组分的抑菌活性更强;抑菌稳定性分析表明,核桃谷蛋白抗菌肽在高温热处理、紫外线、不同pH值下和不同蛋白酶处理后均表现出较好的稳定性。结论：核桃粕谷蛋白抗菌肽在食品抑菌防腐...     

鳕鱼多肽的抗氧化活性及其分离纯化

研究了鳕鱼多肽的抗氧化活性及分离纯化.为获得高纯度的抗氧化肽,将鳕鱼多肽依次通过超滤、凝胶过滤层析、阴离子交换层析(Q-FF)和反相高效液相色谱层析(RP-HPLC)进行分离纯化.结果表明:鳕鱼多肽具有很强的清除羟自由基的能力、清除DPPH的能力和还原能力;经Q-FF柱层析分离得到了B1、B2和B3 3个组分,B2经RP-HPLC检测显示为单一峰,获得了纯度较高的鳕鱼多肽,这为鳕鱼多肽的开发利用提供了科学理论依据.     

产抗菌肽乳酸菌筛选及抗菌肽的分离纯化与特性研究

目的筛选得到产抗菌肽菌株,对抗菌肽进行分离纯化及理化性质研究。方法利用琼脂扩散法筛选产抗菌肽的菌株,运用细胞吸附解吸和阳离子交换层析法纯化抗菌肽,从热稳定性、酸碱稳定性和蛋白酶敏感性3方面研究抗菌肽的理化特性。结果筛选得到7株产抗菌肽的菌株,其中菌株4121具有较广的抑菌谱,命名为鼠李糖乳杆菌4121。对抑菌物质进行分离纯化和理化性质测定,电泳结果显示抗菌肽的分子量约为11 kDa,最终获得的抗菌肽比活力为12379.11 AU/mg,最终纯化倍数为91.99倍。该抗菌肽的抑菌能力在20~80℃及偏酸条件下具有很好的稳定性。同时该抗菌肽对蛋白酶K和α-胰凝乳蛋白酶敏感。结论筛选出的鼠李糖乳杆菌4121所产生的抗菌肽热稳定性及酸稳定性良好,具有广谱抑菌能力,并建立了有效的抗菌肽分离纯化法—细胞吸附解吸-阳离子交换层析法。     

鲫鱼鱼鳞抗菌多肽的制备纯化及其抑菌活性

以鲫鱼鱼鳞为原料,对其预处理后采用柠檬酸浸提酶解等工艺得到鱼鳞抗菌多肽粗酶解液,经透析后,再依次经Sephadex G-15、Sephadex G-50凝胶过滤层析和纤维素DEAE-52阴离子交换层析对其进行分离纯化,最后得到具有较强抑菌活性的鲫鱼鱼鳞抗菌多肽,并对其进行分子质量分析以及对多种细菌、霉菌的抑菌活性和最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）测定。结果表明：经分离纯化后得到的具有抑菌活性的蛋白组分AcIII,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示为单一条带,表明其已达到电泳级纯,其分子质量约为20.1 kDa,抑菌活性测定结果表明鲫鱼鱼鳞抗菌多肽具有很好的广谱抗菌活性,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌、副溶血性弧菌、假单胞菌和希瓦氏菌的MIC为16 μg/mL,对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC为32 μg/mL。     

仿刺参体壁中抗菌肽的分离及抑菌活性

从仿刺参体壁中分离纯化出抗菌肽并研究其抑菌活性。以鲜活仿刺参体壁为原料,采用5%乙酸浸提法进行粗提,以抑菌活性为指标进行分离。经超滤系统超滤,大孔吸附树脂柱层析分离纯化,采用酶标仪比浊法检测各组分对大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、肠炎沙门氏菌（Salmonella eternitidis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的抑菌活性。采用Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,Tricine-SDS-PAGE）检测抗菌肽分子质量。结果表明：通过超滤分离,分别得到分子质量＜1、1～5 kD和5～10 kD组分,其中分子质量＜1 kD组分的抑菌活性最高,选用该组分继续进行大孔吸附树脂柱层析分离,得抑菌活性最高的组分,其Tricine-SDS-PAGE结果表现为单一条带,分子质量约为4.35 kD。     

澳洲坚果抗菌肽分离纯化及其肽段鉴定与分析

以液压压榨澳洲坚果粕为原料,采用碱性蛋白酶水解制备澳洲坚果多肽（macadamia nut peptide-0,MNP-0）,以对金黄色葡萄球菌与白色念珠菌的抑菌活性为跟踪指标,通过超滤、DA201-C型大孔吸附树脂、交联葡聚糖凝胶Sephadex G-25对其进行逐级分离纯化,获得抑菌活性较强的抗菌肽,并运用液相色谱串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）技术对其进行肽段组成与氨基酸序列分析。结果表明：超滤分离的不同分子量澳洲坚果多肽在所有多肽中所占质量分数不同,抑菌活性也有所差异。其中,澳洲坚果多肽组分MNP-4占比最高,为29.55%;抑菌活性也最强,对金黄色葡萄球菌与白色念珠菌的抑菌圈直径分别为10.01 mm与9.41 mm。大孔吸附树脂纯化多肽组分MNP-4的技术条件为75%乙醇溶液为解吸剂,静态吸附3 h,动态洗脱体积60 mL。经大孔吸附树脂与交联葡聚糖凝胶Sephadex G-25分离纯化,获得3个澳洲坚果纯化多肽（macadamia nut purified peptide,MPP）组...     

竹叶天然抗菌肽的分离纯化与抗菌活性研究

利用PBS浸提、硫酸铵梯度盐析、弱阴离子交换色谱DEAE-A50,从竹叶中分离纯化出一种新的抗菌肽。该活性多肽经纯化后在SDS-PAGE上显示为两条带,分子量分别为49 888 Da和45 604 Da。此竹叶多肽对大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表现出良好的抑菌活性。     

清酒乳杆菌ZJ220产细菌素的研究

从生鲜牛乳中分离获得1株能够产生抑菌活性物质的菌株,在排除有机酸、过氧化氢的干扰后,该菌发酵上清液仍有明显的抑菌活性。以蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶处理发胶上清液后其抑菌活性消失,试验表明该菌株产生的抑菌活性物质具有蛋白质性质,初步确定为一种细菌素。经生理生化和16S rDNA鉴定该菌为清酒乳杆菌,命名为Lactobacillus sakei ZJ220。细菌素经疏水洗脱、离子交换、凝胶过滤3步法得到纯化。经Tricine-SDS-PAGE分析该细菌素分子质量为6.0 ku。抑菌谱测定结果表明,该细菌素不仅能抑制革兰氏阳性菌,而且能抑制革兰氏阴性菌。经不同酸、热处理,该细茵素仍有较好的抑菌活性。     

牛骨胶原蛋白源抑菌肽的分离纯化及成分分析

牛骨胶原蛋白经中性蛋白酶水解,采用超滤技术和凝胶层析技术对酶解液进行分离纯化并测定对大肠杆菌的抑菌活性;借助反向高效液相色谱和基质辅助激光解析/离子化串联飞行时间质谱仪对抑菌肽进行分析.结果表明:经超滤分离后,分子质量小于10kD的组分对大肠杆菌的抑菌活性强;Sephadex G-25柱分离得到的峰Ⅰ和峰Ⅳ组分有较强的抑菌活性.经反向高效液相色谱和基质辅助激光解析/离子化串联飞行时间质谱仪分析,峰Ⅰ组分中含有的多肽种类多,分子质量集中在850～1550D之间.峰Ⅳ组分含有的多肽种类较少,分子质量集中在700～900D之间.     

一种苦荞抗真菌肽的纯化及抑菌活性分析

以苦荞种子为材料,经提取、热处理,Resource S 阳离子交换层析及Superdex Peptide 分子筛层析,纯化具有抗真菌活性的多肽。Tricine-SDS-PAGE 分析表明,该多肽的表观分子质量约为8.0kD。表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF)显示其实际分子质量为3.909kD。该抗菌肽对白腐菌(Panus conchatus)、绿色木霉(Trichoderma reesei)和链格孢霉(Alternaria alternata)均表现出显著的生长抑制活性。绿色木霉的形态学分析显示：受到苦荞抗真菌肽影响的菌丝生长停滞,分支加剧,基内菌丝端部膨大,原生质凝缩。该抗真菌肽的制备工艺简单,产品热稳定性好,抑菌作用明显。     

大头金蝇幼虫抗菌肽提取纯化及抑菌活性研究

目的:从大头金蝇幼虫中分离纯化天然抗菌肽,并检测抗菌肽的抑菌活性。方法:提取大头金蝇幼虫抗菌肽,粗提物经凝胶过滤色谱、阳离子交换树脂、反相色谱纯化,纯化产物检测其抑菌活性并利用GFC-HPLC测定其分子量。结果:最终纯化出一个活性组分,该组分对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度为20.40μg/m L,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2.04 mg/m L,对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.17 mg/m L;该活性组分分子量大小为2570 u。结论:该抗菌肽组分对铜绿假单胞菌有较强抑菌活性,有较好的开发利用价值。     

驼乳和牛乳乳清蛋白抑菌肽的分离纯化及抑菌活性的比较

本文以驼乳和牛乳的乳清蛋白为原料,经胃蛋白酶水解后,通过超滤及葡聚糖凝胶层析对其水解物进行分离纯化,其后对获得的蛋白肽进行抑菌活性、二喹啉甲酸法(BCA)蛋白浓度、相对分子质量及氨基酸组成的测定。结果表明:经超滤获得的驼乳和牛乳分子量<3 kDa的多肽片段-F3具有最强的抑菌活性,将F3(<3 kDa)组分通过层析处理得到的驼乳G-25-2和牛乳G-25-2抑菌肽纯度较高(BCA蛋白浓度分别为95.60%和95.32%);驼乳G-25-2和牛乳G-25-2组分对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌作用,最小抑菌质量浓度分别均为32.50和65.00 mg/mL;氨基酸分析结果显示,高活性抗菌肽中的总碱性氨基酸和总疏水性氨基酸含量最高,驼乳G-25-2中分别为32.80%和65.76%,牛乳G-25-2中分别为31.77%和58.70%。本研究结果表明,驼乳与牛乳均具有抑菌效果,且其抑菌能力高于牛乳,为今后研究驼乳抑菌肽的深入研究提供理论参考。     

大菱鲆肠道中广谱拮抗活性乳酸菌的筛选及其细菌素鉴定

应用牛津杯法从大菱鲆肠道分离的乳酸菌中筛选出对革兰氏阳性和阴性细菌均具有抑制作用的菌株LP1-4,经生理生化反应和16S rRNA鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。通过温度、pH值和蛋白酶等因素分析,结果表明菌株LP1-4无细胞上清液（cell-free supernatant,CFS）中抑菌物质具有良好的热稳定性,在pH 2.5～5.0具有抑菌活性,且对蛋白酶敏感,初步判断为细菌素类抑菌物质。菌株LP1-4在最佳培养时间24 h时抑菌活性达到峰值,应用乙酸乙酯萃取后抑菌圈直径达25.42 mm。采用Labscale TFF System超滤分离和Sephadex G-25凝胶层析获得小于1.0 ku分子质量的细菌素。经高效液相色谱纯化分析,抑菌物质在液相分离条件下目标峰的保留时间为5.0 min。采用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱确定细菌素分子质量为0.854 ku,其氨基酸排列顺序为谷氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-赖氨酸（ENKPAAPK）。本研究从大菱鲆肠道筛选具有广谱抗菌活性的菌株LP1-4,对研发控制水产品腐败菌和致病菌的乳酸菌生物防腐保鲜制剂具有潜在的应用价值。     

中华稻蝗内生菌株SDLH抗菌肽的分离纯化

采用PEG 6000沉淀法、DEAE-32阴离子层析和Sephadex G-50凝胶层析分离纯化SDLH抗菌肽,抑菌圈法测定抑菌活性,Bradford法测定蛋白含量,PAGE检测纯度。结果获得分子量为17.0 KD,电泳纯的抗菌肽。     

产抗菌肽肠球菌的筛选及其抗菌肽生物学性质

利用牛津杯琼脂扩散法从新生儿粪便中筛选到一株产广谱抗菌肽的乳酸菌菌株,经菌体形态观察、生理生化分析、全自动微生物基因指纹鉴定系统和16S r DNA序列分析确定该菌株为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。经过氧化氢酶处理后,发酵上清液仍具有抑菌活性,而胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K处理后,抑菌活性基本消失,说明该抑菌物质为蛋白类似物,即抗菌肽。该菌株所产抗菌肽在p H2.0~5.0范围内保持活性,45~100℃处理1 h后抑菌活性基本不变。发酵液中的抗菌肽经液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)和数据库APD比对得出3条不同的抗菌肽氨基序列,具有重要的研究价值。     

西藏干酪源植物乳杆菌产细菌素的分离纯化及特性研究

从西藏干酪中分离筛选出1株能够产生抑菌活性物质的乳酸菌,该菌的发酵上清液在排除有机酸、过氧化氢的影响后仍有显著抑菌活性,然而,用胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶处理后抑菌活性丧失,说明该菌的代谢产物中起抑菌作用的物质具有蛋白质性质,初步确定是一种细菌素。结合形态学观察、生理生化分析及16S rDNA鉴定结果,确定该菌为植物乳杆菌,命名为ZFM804。细菌素经大孔树脂(XAD-16)层析、强阳离子交换层析、RP-HPLC三步法初步纯化。经SDS-PAGE分析该细菌素分子质量约为15 ku。理化性质分析表明该细菌素具有良好的酸碱稳定性:在pH 3~11范围内都具有抑菌活性;良好的热稳定性:100 ℃处理30 min仍有明显抑菌活性,同时可被人体内蛋白酶降解。抑菌谱测定结果表明,ZFM804植物乳杆菌素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑制作用,是一种广谱细菌素。     

1 株广谱抗菌活性菌株的筛选鉴定及其抗菌蛋白的分离纯化

从湖南传统腊肉中分离筛选得到1 株具有广谱抑菌活性的菌株HLR13,该菌株发酵液对蜡样芽孢杆菌、荧光假单胞菌、藤黄微球菌和肠炎沙门菌等食品中常见的致病菌具有较强的抑制活性。通过形态学特征、生理生化特征及16S rRNA序列分析,该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌斯皮兹仁亚种（Bacillus subtilis subsp. spizienii）。采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析（Q Sepharose FF）和凝胶过滤层析（Sephadex G-75）等方法对该菌株所产抗菌蛋白进行分离纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示纯化后的蛋白为单一条带,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析和NCBI/nr蛋白数据库比对初步确定该抗菌蛋白分子质量为31?494?Da,是枯草芽孢杆菌产生的一种假定蛋白。本实验可为新型天然防腐剂的开发提供一定理论依据。     

中国林蛙(Rana chensinensis)蛙皮抗菌肽的制备及抗菌作用研究

目的从中国林蛙的皮肤中，提取纯化具有抗菌活性的多肽物质，并对其进行抑菌活性的研究。方法用甲醇进行粗提取。对提取的甲醇浓度、甲醇用量、浸提时间和浸提次数，采用L9（3^4）正交实验，以蛋白含量作为指标，确定最佳提取条件。得到的粗提物经Sephadex G-75、Sephadex G～50和Sephadex G-25凝胶过滤进一步分离纯化获得抗菌肽。对抗菌肽进行氨基酸组成分析，采用杯碟法进行抑菌活性研究。结果提取林蛙抗菌肽的最佳工艺条件：甲醇浓度80％、甲醇体积为蛙皮重量的6倍、提取时间24h，提取次数3次。提取的粗提物经凝胶过滤后得到抗菌肽。抗菌肽的氨基酸组成中，碱性氨基酸占22．1％。酸性氨基酸占13．9％。抗菌肽对细菌的最低抑菌浓度分别为：枯草杆菌73．25μg/ml，金黄色葡萄球菌51．75μg/ml,大肠杆菌51．75μg/ml，铜绿假单胞菌51．75μg/ml。结论经甲醇提取和凝胶过滤可从中国林蛙皮肤得到抗菌肽。该抗菌肽为碱性多肽，对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌均有抑制作用。     

辣椒籽抗菌肽提取条件优化及分离纯化

以黄曲霉为指示菌,抑菌圈直径为考察指标,比较不同辣椒籽蛋白提取物的抑菌效果。结果显示,6 种辣椒籽均对黄曲霉生长有抑制作用,其中贵州灯笼椒的抑菌效果最好。以该品种辣椒籽为后续实验原料,对其提取条件进行优化。获得最佳提取条件为：浸提液为乙二胺四乙酸缓冲液,料液比1∶5.05（g/mL）、浸提时间16.13 h、硫酸铵饱和度81.15%。在此优化条件下,辣椒籽抗菌肽抑菌圈直径可达23.89 mm,比优化前（12.34 mm）提高了93.06%。结合透析袋脱盐、10 kDa超滤管超滤以及葡聚糖凝胶层析,对辣椒籽抗菌肽进行分离纯化,纯化后的抗菌肽经Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测已达到电泳纯,分子质量在7.8 kDa左右。     

红豆杉内生放线菌的分离及活性菌株的筛选与鉴定

通过组织匀浆法分离红豆杉(Taxus chinensis)根、茎、叶3个部位的内生放线菌,采用滤纸片法初步研究了内生放线菌发酵液的抑菌活性,并对抑菌活性明显的菌株进行了分子鉴定。结果表明,分离纯化得到内生放线菌55株,抑菌活性试验中共有21株表现出了不同程度的拮抗作用,占全部分离菌株的38.2%,其中4株具有明显的抑菌活性。经16SrDNA序列分析,初步鉴定3株为链霉菌属(Streptomyces sp.),1株为小单孢菌属(Micromonosporasp.)。