副溶血性弧菌微滴数字PCR定量方法的建立

目的:采用微滴式数字PCR技术(Droplet digital PCR,ddPCR),建立副溶血性弧菌快速定量检测。方法:以副溶血性弧菌TLH基因为靶基因,验证确定ddPCR方法的特异性及定量检测的线性范围,以常检出副溶血性弧菌的海产品鳕鱼为样品进行阳性添加,确定方法的可行性。结果:本试验中采用ddPCR检测得到副溶血性弧菌特异性好,有效基因组DNA浓度范围为2~19440拷贝/20μL,分析得菌悬液浓度为50~4.86×10⁵ CFU/mL,与3M测试片所得菌悬液浓度无显著性差异(p>0.05),与荧光PCR相比,可以进行更低浓度检测且能准确定量。结论:副溶血性弧菌ddPCR定量检测技术特异性良好、灵敏度高、结果准确,具有实际应用价值。     

猪链球菌微滴数字PCR定量检测方法的建立

根据猪链球菌(Streptococcus suis,SS)gdh基因的保守序列设计特异性引物和Taq Man探针,通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的检测,建立可对其准确定量的微滴数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法进行比较分析。结果表明,该方法特异性良好,与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪圆环病毒2型和伪狂犬病毒无交叉反应;灵敏度优于qPCR,线性相关系数(R2)为0.991,呈良好线性关系,最低可检测到2.692 copies/μL的阳性质粒;稳定性好,变异系数为1.66%。临床样品定量检测结果表明,dd PCR具有敏感性高、特异性好等优点,能对qPCR检测的可疑样品进行精确定量。本研究建立的dd PCR能够准确定量检测SS,将为SS相关研究提供有益参考。     

液滴数字PCR定量检测鸭血制品中掺假成分

鸭血制品作为市场常见商品,掺假现象十分严重。选取鸡、鸭、鹅基因组中的特异性单拷贝基因为靶基因,设计引物和探针,建立鸡、鸭、鹅血微滴数字PCR定量检测方法。使用人工混合样品对该方法的准确性进行验证,同时通过检测市售样品来验证方法的适用性。实验结果表明,样品含量在1~1000 μg/mg时,靶基因拷贝数与样品质量之间具有良好的线性关系,检测限和定量限分别为5 μg/mg和1 μg/mg。通过人工混合样品和市售样品检测证明,该方法具有良好的准确性和适用性,可用于对鸡、鸭、鹅血制品的定量检测。     

肉制品中羊源性成分微滴数字PCR法定量检测方法的研究

为准确定量肉及肉制品中羊源性成分的含量,建立了微滴数字PCR定量检测系统。结果显示在一定范围内羊肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,选择DNA含量作为中间换算值,计算出羊肉的质量与拷贝数之间的关系为M_羊=0.03C+0.69。应用建立的微滴数字PCR定量检测方法对已知质量分数的羊肉模拟混合样品进行检测,发现无论在两两混合还是多肉样混合的情况下,其含量偏差最大为1.52%,具有较强的抗干扰能力。通过对市售样品的检测,显示该方法能够准确检测出不同样品中羊肉的含量,并发现可能存在掺假现象,说明该检测方法具有良好的市场应用前景。本实验建立的微滴数字PCR定量方法在肉及肉制品中羊源性成分检测方面具有较大的应用潜力,为肉制品日常检测及是否掺假提供有力的科学依据。      

肉制品中羊源性成分微滴数字PCR法定量检测方法的研究

为准确定量肉及肉制品中羊源性成分的含量,建立了微滴数字PCR定量检测系统。结果显示在一定范围内羊肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,选择DNA含量作为中间换算值,计算出羊肉的质量与拷贝数之间的关系为M_羊=0.03C+0.69。应用建立的微滴数字PCR定量检测方法对已知质量分数的羊肉模拟混合样品进行检测,发现无论在两两混合还是多肉样混合的情况下,其含量偏差最大为1.52%,具有较强的抗干扰能力。通过对市售样品的检测,显示该方法能够准确检测出不同样品中羊肉的含量,并发现可能存在掺假现象,说明该检测方法具有良好的市场应用前景。本实验建立的微滴数字PCR定量方法在肉及肉制品中羊源性成分检测方面具有较大的应用潜力,为肉制品日常检测及是否掺假提供有力的科学依据。     

微滴式数字PCR定量检测欧洲甜樱桃中掺假苹果成分的研究

目的:基于微滴式数字PCR技术（Droplet Digital PCR,ddPCR）建立欧洲甜樱桃中掺假苹果成分定量检测的方法。方法:通过筛选欧洲甜樱桃、苹果成分特异性引物探针,建立ddPCR定量检测方法,构建质量和DNA含量的拟合曲线及DNA含量与拷贝数之间的拟合曲线,以DNA含量作为中间值,获得质量和扩增拷贝数的计算公式。其中线性拟合曲线R2均在0.99以上,且建立了相应的掺假模型以验证方法的准确性。结果:欧洲甜樱桃和苹果的质量和扩增DNA拷贝数的计算公式:M_樱=0.0833C?3.8420、M_苹=0.4084C?1.5747。在欧洲甜樱桃与苹果的掺假模型中相对误差最大为?19.17%,符合统计学要求。结论:建立欧洲甜樱桃制品快速检测方法为打击欧洲甜樱桃掺杂使假提供了强有力手段,保障了消费者的权益,对促进小浆果及其制品行业健康发展具有重要意义。     

副猪嗜血杆菌微滴数字PCR定量检测方法的建立

根据副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)OMP P2基因的保守序列设计特异性引物和Taq Man探针,通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的检测,建立可对其准确定量的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法进行比较分析。结果表明,该方法与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及猪圆环病毒2型、猪瘟病毒无交叉反应;其灵敏性优于qPCR,线性相关系数(R2)为0.996,呈良好线性关系,最低可检测到2.647 copies/μL的阳性质粒,变异系数为3.29%。临床样品定量检测结果表明,ddPCR具有敏感性高、特异性好等优点,其检出率稍高于qPCR。本研究建立的ddPCR能够准确定量检测HPS,将为HPS相关研究提供有益参考。     

四种基因定量方法对实时荧光PCR与微滴式数字PCR检测霍乱弧菌基因表达量的分析

基因表达量测定对基因功能解析和探索生命机理具有重大意义,目前实时荧光PCR和微滴式数字PCR技术是进行基因表达量测定的有效方法。本文以低温处理的霍乱弧菌sfs、vcc、Rec A、hly及16S r RNA基因为研究对象,分别用实时荧光PCR和微滴式数字PCR技术对低温处理前后霍乱弧菌的上述基因表达量进行测定,实时荧光PCR实验数据分别采用??CT和ge Norm法进行分析,微滴式数字PCR实验数据分别采用相对定量和绝对定量法进行分析,获得处理组基因表达量相对于对照组的变化倍数;使用多维尺度法来分析四种基因定量方法的数据。结果表明,在本实验条件下,四种基因定量方法的分析结果存在差异;16S r RNA基因表达量发生了变化,不适合作为内参基因;微滴式数字PCR能更直观的给出基因表达量变化的结果,并且基因表达差异相对定量分析的准确度更高。     

微滴式数字PCR与实时荧光PCR检测羊肉制品中羊源和猪源性成分方法的比较

参考外文文献中羊肉和猪肉的特异性引物及TaqMan探针,分别建立一种定量检测羊肉制品中羊源和猪源性成分的微滴式数字PCR方法,并将该方法与标准SN／T 2051－2008中实时荧光PCR方法做对比来检测3份羊肉制品中的羊源和猪源性成分。结果表明,实时荧光PCR方法检测5号、9号、23号样品中的羊源性成分的Ct值分别是14?424／19?214、18?345／20?147、17?321／20?542;猪源性成分的 Ct 值分别是18?923／34?483、20?121／28?963、20?352／33?851;微滴式数字PCR方法检测5号、9号、23号样品中的羊源和猪源性成分的DNA拷贝数分别为236／0 copies／μL、421／0?3copies／μL、402／0?11copies／μL。表明两种方法均能检出3份样品中均含有羊源和猪源性成分,而微滴式数字PCR方法能够对DNA模板定量分析。结论：在肉种成分真伪鉴定上,微滴式数字PCR方法较实时荧光PCR方法更科学、准确。     

微滴式数字聚合酶链式反应精准定量检测羊肉中掺杂猪肉

以羊和猪的单拷贝持家基因DNA复制蛋白A1为靶基因设计合成了适用于微滴式数字聚合酶链式反应的特异性引物和探针,通过理论推导获得了单位质量两种肉基因拷贝数之比的固定值,并进行了验证,据此将样品中羊肉和猪肉的拷贝数转换为相对质量分数,从而建立了羊肉中掺杂猪肉的精准定量检测方法。该方法可以很好地应用于羊肉中掺杂猪肉的含量检测,猪肉的最低定量限为1%,在5%~80%范围内绝对误差小于±1.30%,相对误差小于±10%,定量结果准确、重复性高,可以为肉类掺假的监管工作提供有力的技术参考。     

红薯源性成分微滴式数字PCR的检测与定量分析

本文根据红薯单拷贝物种基因β-淀粉酶基因(Ipomoea batatas beta-amylase gene,β-AMY)特异性片段设计引物组和探针,建立了红薯成分特异性定量检测的微滴数字PCR检测方法及β-AMY基因拷贝数浓度(copy number/μL)与红薯质量(mg)的线性关系,并对方法的特异性、灵敏度和适应性均进行了测试。结果显示建立的红薯成分数字PCR检测方法特异于红薯成分检测,在20μL反应体系中定量下限(limit of quantitation,LOQ)和检测下限(limit of detection,LOD)分别为2.53 copies/μL和0.67 copies/μL。根据建立的拷贝数浓度(copy number/μL)与红薯质量(mg)的线性关系,对红薯质量百分比为5%和25%的样本进行定量检测,检测结果经换算得到的红薯含量分别为4.15%和21.33%,回收率分别为83.06%和85.31%,RSD值在6.33%～6.95%之间,表明本方法可对质量百分比为5%及以上的红薯成分进行准确定量,在定量检测方面具有较大应用潜力,可为市场监管提供了技术支持。     

猪胸膜肺炎放线杆菌微滴数字PCR定量检测方法的建立

为实现对猪胸膜肺炎的致病菌猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的量化研究,本实验根据猪胸膜肺炎放线杆菌特异性基因ApxⅣ的保守序列,设计引物探针,通过优化反应条件,建立可对其准确定量的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度、稳定性以及适用性进行验证,与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法进行比较分析。结果表明:ddPCR最佳退火温度为52℃;线性相关系数(R~2)为0.9957,线性关系良好;灵敏度达153.8copies/μL,是qPCR的两倍;特异性良好,与其它常见猪病原无交叉反应。在实际样品检测中,110份样品的ddPCR与qPCR检测结果的Kappa系数为0.9529,说明两种检测方法结果高度一致,并且ddPCR可对qPCR无法判断阴阳性的可疑样本进行定量分析。本实验建立的ddPCR方法敏感性高、特异性强、可用于猪胸膜肺炎放线杆菌的定量检测。     

微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中金黄色葡萄球菌

基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR)技术,建立发酵乳中金黄色葡萄球菌定量检测方法。以金黄色葡萄球菌nuc基因为目的片段设计特异性的引物和探针,优化反应体系,通过活菌提取和ddPCR方法对靶标基因的检测特异性和灵敏度进行实验,并对定量结果进行分析。本研究建立了发酵乳中ddPCR技术定量检测金黄色葡萄球菌的方法,检测特异性良好,检测灵敏度为3.3×10~1 CFU/g,定量的偏差率为+10.18%,证明了ddPCR用于绝对定量检测的可行性,为其他食品污染菌和致病菌标准化控制体系提供有益的示范作用。     

水产品中副溶血性弧菌PMA-ddPCR活菌定量检测方法的研究

本研究旨在针对水产品中活的副溶血性弧菌建立一种快速定量的PCR检测方法。基于叠氮溴化丙锭(PMA)在一定光照条件下能抑制死亡菌DNA扩增,以及微滴式数字PCR技术能将检测精度扩展至单分子目标基因,并实现绝对定量的特点,以副溶血性弧菌tlh基因为目的片段设计及筛选适合的特异性引物与探针,优化反应体系,通过对PMA浓度及曝光条件等优化,建立了一种联用PMA-dd PCR技术快速检测水产品中活的副溶血性弧菌的定量检测方法。研究结果显示:选择16μg/m L作为PMA工作浓度,曝光时间为8 min,此条件下能够完全抑制副溶血性弧菌死菌的DNA扩增并对活菌扩增无影响。通过对比PMA-dd PCR和PMA-q PCR的检测低限分别为2×10~1 cfu/mL、2×10~2 cfu/mL,PMA-dd PCR法的灵敏度比PMA-q PCR法的高。应用PMA-dd PCR定量方法检测人工污染的基围虾和小帆立贝这两种海产品,在基围虾中最低可检出1.9×10~1 cfu/g的副溶血性弧菌、在小帆立贝中最低可检出8.9 cfu/g的副溶血性弧菌。该研究为将PCR技术实际应用于水产品中低量污染、活的副溶血性弧菌的定量检测奠定了基础。     

铜绿假单胞菌LAMP快速检测方法建立及微滴数字PCR验证

目的:采用环介导等温扩增技术建立铜绿假单胞菌快速检测方法,并用微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)技术进行方法验证。方法:以铜绿假单胞菌rpod基因为靶基因设计引物,建立了果汁饮品铜绿假单胞菌快速检测方法,对于方法的可靠性、特异性和灵敏度,采用ddPCR验证。结果:本实验建立的LAMP快速检测方法显色结果明显,ddPCR检测,以铜绿假单胞菌悬液浓度为横坐标,以数字PCR扩增copy数为纵坐标,生成标准曲线y=0.07497x-9.3516,线性关系良好,R²=0.9999。铜绿假单胞菌检测范围1.5×10²~1.5×10⁵ CFU/mL;方法灵敏度高、特异性强,标准菌株最低浓度为1 ng/μL;标准差分别为0.57、0.71、4.24、14.8,RSD值在0.66%~22.8%之间。检测果汁饮品128份,126份未显色,显色样品2份,以标准曲线定值,浓度分别为1.64×10⁴、2.29×10² CFU/mL。     

利用微滴式数字PCR技术检测大豆毛油中的转基因成分

我国是转基因大豆的进口大国,由转基因大豆加工而成的大豆油成为进入消费者生活的食用油,判定食用的大豆油是否含有转基因成分,是国家监管部门和公众消费者密切关心、关注的问题。大豆油在制备精炼过程中破坏了大豆的DNA,造成检验时DNA富集难度增加,严重影响了大豆油转基因成分检测的准确度。到目前为止,国家已经颁布的标准中没有涉及转基因大豆油的检测标准。本研究利用高灵敏度、精确度的数字PCR技术,并通过优化大豆毛油DNA提取方法和PCR反应体系,对大豆毛油样品进行外源转基因成分检测。检测结果显示,大豆毛油外源转基因成分被成功检测到。实验结果表明,本研究建立的大豆毛油转基因成分检测方法准确可靠,可进行推广应用。