库巴德巴利酵母FBKL2.0130 D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因的克隆表达及酶学性质研究

该研究从库巴德巴利酵母FBKL2.0130中克隆D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因ARD,利用闪电克隆技术构建重组质粒Yep-PAK,并将重组质粒导入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W303-1A中,得到重组菌株W303-ARD并成功表达。并对重组菌株和亲本菌株的生长性能进行测定,并对重组D-阿拉伯糖醇脱氢酶酶学性质进行研究。结果表明,与亲本菌株相比,重组菌株的D-阿拉伯糖醇脱氢酶的还原活力从（32.7±0.803） U/mL提高至（122.4±1.012） U/mL,氧化活力从（18.46±0.105） U/mL提高至（97.30±0.826）U/mL。重组D-阿拉伯糖醇脱氢酶的最适反应温度为30 ℃,在25～40 ℃范围内氧化、还原活力均保持稳定。还原反应的最适pH值为9.0,在pH 9.0～11.0范围内比较稳定;氧化反应的最适pH值为7.0,在pH 7.0～8.0的范围内能保持较高的活性。Cu2+、Ba2+、Zn2+均能抑制重组酶活力;Mg2+对重组酶活力无明显影响;Ca2+、Mn2+、Fe3+均能提高重组酶活力。     

重组草酸脱羧酶的表达及酶学性质研究

研究了重组草酸脱羧酶的表达及其酶学性质。经IPTG诱导,每克湿重菌体收获草酸脱羧酶活力820U,经Ni-NTA亲和层析酶液纯化2.07倍,酶活力回收60.38%。酶促反应的最适温度为50~55℃,最适pH值为3.5,添加EDTA及Fe2+对酶活力有促进作用,Mn2+抑制酶活。在pH4.0,温度37℃下Km值为14.53 mmol/l,Vmax为133.33 U/mg。     

谷氨酰胺酶基因的克隆、表达和酶学性质研究

以枯草芽孢杆菌基因组为模板通过PCR扩增获得谷氨酰胺酶基因ylaM,构建重组质粒p MA5-ylaM,将其转化到枯草芽孢杆菌168中获得重组菌BS168/pMA5-ylaM,并在宿主菌成功得到表达,纯化后的谷氨酰胺酶比酶活大小为939.48 U/mg。谷氨酰胺酶的反应最适pH为7.5,反应最适温度为55℃,La~(3+)、Zn~(2+)、Fe~(3+)和Al~(3+)对谷氨酰胺酶活力具有一定的抑制作用,在NaCl浓度为15%～17.5%的条件下,该酶酶活力可以保留50%以上。在5 L罐中,通过分批补料发酵,其最高酶活力产量为215.06 U/mL。     

耐酸性高温α-淀粉酶突变基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用表达载体pET-30a,实现了去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd及未突变的高温α-淀粉酶基因amy在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达。经多步纯化,重组酶AMY及AMYD的比活分别达到312.7U/mg蛋白和354.6U/mg蛋白,纯化倍数分别为75.90和83.83,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,AMY及AMYD酶分子质量均为63.5ku。重组酶AMY的最适温度80℃,最适反应pH为6.5,在温度低于90℃,反应pH5.5~7时,酶活较稳定。重组酶AMYD的最适温度80℃,最适反应pH为4.5,在温度低于90℃,反应pH4.0~6.5时,酶活较稳定。     

外切型琼胶酶AgaO的高效表达及酶学性质表征

根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化外切型琼胶酶AgaO的基因并人工全合成,克隆入表达载体质粒pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件即诱导温度、诱导时间和诱导剂IPTG终浓度,纯化重组蛋白rEAgaO,并分析其酶学性质变化。结果表明,重组酶rEAgaO在16 ℃、IPTG终浓度0.1 mmol/L条件下诱导20 h时表达量最高;95%以上的重组蛋白质为水溶性表达,产量约为1432.7 mg/L,较优化前原始基因的产量提高了10.9倍;重组酶rEAgaO的最适反应温度为45 ℃,在低于40 ℃的温度下预处理2 h后,仍然具有90%以上的残余活性,最适pH为7.0,在pH6.0~10.0不同缓冲体系4 ℃处理2 h仍保留69.5%以上的活性;该酶降解琼脂糖后的最终产物经TLC分析鉴定为新琼二糖。基因密码子优化虽不改变蛋白质氨基酸序列,但可明显提高水溶性重组蛋白质的产率及酶活,对促进相关酶类的生产和应用具有借鉴意义。     

曲霉来源果胶裂解酶PnlF的克隆表达及酶学性质分析

果胶裂解酶是一类通过β-消除机制降解果胶的多糖裂解酶，对果胶的利用具有重要意义。该研究利用真核表达载体，克隆表达了来自曲霉属Aspergillus costaricensis的酸性果胶裂解酶PnlF,经过亲和层析和凝胶过滤层析对该酶的发酵液进行了分离纯化，并对其酶学性质和降解果胶的产物进行了系统性研究。该研究成功实现了PnlF在毕赤酵母中的分泌表达，粗酶活力达到526 U/mg。PnlF的最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0;其酶活力在20～30℃及pH 5～6内稳定。Ca²⁺和Mg²⁺可以大幅度提高PnlF的活力；而Ag⁺和Cu²⁺则会严重抑制其活力；此外SDS、TritonX-100、苯甲磺酰氟等化学试剂对该酶活性的抑制作用较强。     

产胆固醇酯酶毕赤酵母发酵条件优化及酶学性质研究

为实现胆固醇酯酶的高效发酵,以成功表达的毕赤酵母工程菌株P.pastoris X-33为研究对象,通过单因素和正交试验对其发酵条件进行优化。结果表明:最适培养基组成为:酵母浸粉含量1.0%、蛋白胨浓度1.5%、甘油含量1.0%、KH₂PO₄ 1.18%、K₂HPO₄ 0.3%、生物素4×10-5%、YNB 1.34%;在初始pH7.0,30 ℃发酵96 h条件下,酶活力可达11.21 U/mL,较于优化前提高了3.65倍。酶学性质结果显示,该酶最适pH和最适反应温度分别为8.0和50 ℃,Zn2+对酶有较强的抑制性。该胆固醇酯酶酶学性质较为稳定,可为今后的规模化应用提供技术基础。     

一种Kappa-卡拉胶酶的克隆、表达及其酶学性质研究

将来源于Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5菌株的κ-卡拉胶酶基因克隆到载体p ET-28a上,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达。克隆得到的κ-卡拉胶酶基因序列全长1194 bp,编码一个由398个氨基酸残基组成的蛋白酶,该蛋白酶的分子量为48 ku,结构域分析表明该κ-卡拉酶符合GH16家族的特点。对重组κ-卡拉胶酶的酶学性质进行考察:重组κ-卡拉胶酶只能够专一性的降解κ-卡拉胶;该酶的最适温度和pH分别是55℃和pH 9.0,重组酶在40℃保温1 h可保持95.0%的活性,在45℃保温1 h残余酶活与对照比较仍保留60.0%,在pH 8.0~10.0的缓冲液中处理30 min,仍能保持80%以上的酶活力,低浓度的Na+和K+以及1mmol/L的Sn~(2+)、Fe3+、EDTA、DTT、Tween-20、Tween-80和Triton X-100、β-mercaptoethanol、SDS、Urea对重组酶活具有显著的促进作用;而高浓度的Na+和K+以及1 mmol/L的Cd~(2+)、Ba~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、Ca~(2+)对重组酶活性有不同程度的抑制作用。     

黑曲霉金属蛋白酶的克隆表达与性质鉴定

在毕赤酵母中克隆表达黑曲霉CGMCC 3.7193中一个疑似金属蛋白酶基因MPase,分离纯化后对重组酶MPase进行理化特征分析.结果显示,纯化后的MPase:比酶活达到1859.2 U/mg,最适反应温度35℃,最适反应pH7.0;在低于40℃,pH5.0～8.0之间稳定;偏好水解大豆分离蛋白,Km和Vmax分别为...     

Bacillus sphaericus DS11蛋白酶基因osp在Bacillus subtilis的异源表达及酶学性质研究

将Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因osp在Bacillus subtilis WB800异源表达,并进行纯化和酶学性质研究。以Bacillus sphaericus DS11基因组DNA为模板,扩增osp基因,构建重组质粒pMA0911-His_6-osp,重组质粒转化Bacillus subtilis WB800获得重组表达菌株Bacillus subtilis WB800-pMA0911-His_6-osp。利用镍离子柱亲和层析纯化重组酶至电泳纯。重组酶最适催化温度和pH值分别为40℃和pH 8.0,在20℃～30℃下保温10 h保持80%以上酶活力,在pH 7.0～9.0处理24 h保持60%以上酶活力;Sr~(2+)、K~+、Mg~(2+)对酶活有促进作用,Fe~(3+)、Ba~(2+)、Ca~(2+)对酶活有抑制作用;重组蛋白酶在极性常数为0.8～3.1的有机溶剂中孵育6 d后保持53%以上的酶活力。     

黄曲霉产β-1,4-木聚糖酶发酵条件的优化及其酶学特性

研究发现一株高产β-1,4-木聚糖酶的黄曲霉,拟优化其产酶条件并分析该酶的酶学特性。采用单因素法优化其摇瓶发酵条件,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合酶谱法判定酶的特性以及薄层色谱分析法(TLC)判定酶的水解特异性。结果表明,产酶最佳培养基为:麸皮3.5%、磷酸氢二铵3.0%、吐温-60 1.0%、NaCl 0.5%、MgSO₄·7H₂O 0.05%和KH₂PO₄ 0.075%;黄曲霉在35 ℃下培养5 d达到最高酶活力115.08 U/mL,为未优化时的9.4倍。该菌能分泌两种β-1,4-木聚糖酶,分子量约为20.1和31.0 kDa,均不同于已有报道。粗酶的最适pH和最适温度分别为MOPS 7.5和55 ℃,在pH5.5~9.0及30~50 ℃范围内能保持酶活力的稳定。该酶不仅能水解榉木木聚糖产生低聚木糖,还能微弱降解大麦葡聚糖,有助于它在木质纤维素降解领域中的应用。     

海藻酸钠裂解酶高产菌株的筛选、鉴定及产酶条件的优化

以海藻酸钠为唯一碳源培养基,对广西北海涠洲岛采集的马尾藻进行微生物的筛选和分离,采用 3, 5-二硝基水杨酸法 (DNS)进行海藻酸钠裂解酶相对酶活力测定,获得高产酶菌株M0101;依据形态、生理生化特征及 16S rDNA 序列分析对其进行鉴定,该菌属于弧菌属,命名为Vibrio gangliei M0101;通过单因素实验确定了菌株M0101的产酶优化方案:海藻酸钠50 g/L,(NH₄)₂SO₄ 2 g/L,K₂HPO₄ 1 g/L,NaCl 100 g/L,MgSO₄·7H₂O 1 g/L,FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L,培养温度30 ℃,初始pH9.0,200 r/min;优化后菌株 M0101产酶最大活性可达221.90 U/mL,相较于优化前最大酶活36.32 U/mL,优化后酶活力是优化前的6.11倍。表明M0101能高效水解高浓度海藻酸钠,是强耐盐的菌株,具有大规模制备海藻酸钠裂解酶的潜力。     

烟草赤星病菌(Alternaria longipes)产角质酶液体发酵条件的优化

以基础培养基（查彼培养基＋碳酸钙＋苹果角质）为营养优化了长柄链格孢(Alternaria longipes)产角质酶的环境和营养条件。结果表明最佳产酶的环境条件是：培养时间8 d,培养温度25 ℃,pH 5.5;通过正交试验确定最佳产酶的营养条件是：蔗糖3％,干酪素1％,吐温-80 0.3%;酶活高达175.2 U/mL,是基础培养基酶活力的11.0 倍。     

高碘酸钠氧化法固定化磷脂酶A1的研究

研究了高碘酸钠氧化法在纤维素滤纸膜载体上固定化磷脂酶A₁的最佳条件。结果表明,以固定化酶活力为指标,当高碘酸钠浓度为0.15mol/L,活化80min,与浓度为0.05g/mL酶的磷酸盐缓冲溶液（pH为5.8）于戊二醛浓度0.4%、温度4℃交联4h,获得的固定化磷脂酶A₁酶活最高为4.8U/cm²。固定化酶膜的酶学性质为:最适温度35℃;最适pH为9.0。与游离酶相比,pH向碱性偏移1.0;经7次重复使用后,固定化酶膜活力为原酶活的65%以上。SEM结果显示,经高碘酸钠氧化后的纤维素滤纸膜能较好地固定磷脂酶A₁。     

南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及其硅藻土固定化应用

为提高南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B,CALB）表达量,根据黑曲霉（Aspergillus niger）密码子偏好性设计合成CALB基因,以PnaII/tpi为启动子构建CALB表达载体并转化到黑曲霉HL-1中表达,摇瓶发酵120 h后上清液中重组CALB活力为171 U/mL。研究重组CALB的酶学性质,最适反应温度和pH值分别为50 ℃和8.0,在pH 6.0～9.0和45 ℃以下具有较高的稳定性,10 mmol/L Cu2＋、Zn2＋和0.1 g/100 mL十二烷基硫酸钠强烈抑制酶活力,而1 mmol/L Ca2＋、0.1 g/100 mL山梨醇对酶活力具有非常明显的激活作用。此外,以硅藻土为载体固定CALB,固定化酶活力为187 U/g。将制备的硅藻土-CALB固定化酶用于生物合成己酸乙酯,经反应条件优化后在无溶剂体系中己酸乙酯产率达91%。     

假丝酵母氨基甲酸乙酯水解酶的分子克隆及酶学性质

氨基甲酸乙酯是存在于发酵食品中的一种潜在致癌物.生物酶法可有效降解氨基甲酸乙酯.该研究从假丝酵母CCTCC AY 2017001基因组中克隆了氨基甲酸乙酯水解酶基因cpUH,并实现了其在Escherichia coli中的高效表达.实验结果表明,cpUH基因大小为1656 bp,编码552个氨基酸;重组蛋白大小约为60...     

牛肾溶菌酶的分离纯化及部分酶学性质

将新鲜牛肾匀浆后,经由缓冲液提取,正丁醇除脂,硫酸铵分级沉淀,CM-Sepharose阳离子交换层析,Superdex-200凝胶过滤层析后得到电泳纯的牛肾溶菌酶。结果表明：该酶比活力为15 145.63 U/mg,回收率为29.13%,纯化倍数为231.05;分子质量约12.66 kD,为单亚基酶。最适反应温度为65 ℃,在65 ℃以下较稳定;最适pH 9.0,pH值在3.0～9.0范围内稳定性较好;测得最适条件下牛肾溶菌酶对溶壁微球菌的Km值为0.399 μg/mL;甲醇、乙醇、异丙醇和硫氰化钾（KSCN）对该酶有激活作用;十二烷基硫酸钠、Pb2＋、Ag＋对该酶有明显抑制作用。     

淀粉液化芽孢杆菌BS5582中性蛋白酶基因的克隆表达及其酶学性质研究

以一株高产中性蛋白酶的Bacillus amyloliquefaciens BS5582基因组DNA为模板,PCR扩增获得结构基因npr,构建质粒pPIC9K-npr,并转化到表达菌株毕赤酵母GS115中得到重组菌。经甲醇诱导发酵,测定中性蛋白酶活性。结果表明,目的基因大小为1566bp,在宿主中得到了成功表达,重组菌酶活力为9.17×103U/g,酶学性质分析表明,重组中性蛋白酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为7,在40℃中保温1h后仍能保持85%左右活性,在pH4～9的范围内稳定性较好,Ca2+、Mg2+、Mn2+离子对该酶有激活作用。