产淀粉酶芽孢杆菌的分离和鉴定

从土壤中分离筛选出产淀粉酶的菌株,经淀粉培养基初筛后,采用DNS法对发酵提取的粗酶液进行总酶活和α-淀粉酶活力的测定,通过形态观察和生理生化反应对筛出的菌株进行鉴定。结果表明:分离到4株产淀粉酶芽孢杆菌,测得其透明圈直径与菌落直径比值在1.7~3.5之间,其中有2株菌株产淀粉酶能力较高,总酶活达到19.760 U/mL和15.432 U/mL;4株芽孢杆菌所产α-淀粉酶酶活在6.4 U/mL~10.4 U/mL之间。经鉴定,1株为枯草芽孢杆菌,3株为蜡样芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌的产淀粉酶能力优于蜡样芽孢杆菌。     

重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌构建与表达

根据GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR克隆α-淀粉酶基因(amy),将α-淀粉酶基因插入穿梭表达载体pP43C,构建重组质粒pP43Camy。随后将重组质粒转化八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌WB800,经筛选获得重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌WB800/pP43Camy1026,工程菌摇瓶发酵酶活力达960U。性质研究表明,重组α-淀粉酶的最适作用温度为70℃,最适反应pH为6.0,具有良好的应用潜力。     

D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。     

耐热异淀粉酶的高效表达及其在麦芽糖浆制备中的作用

淀粉酶法制备高麦芽糖浆工艺中,淀粉液化酶、脱支酶以及β-淀粉酶不可或缺,其中脱支酶是决定淀粉转化为麦芽糖的转化率高低的关键因素。在工业上常用的两种脱支酶中,异淀粉酶比普鲁兰酶能更好地协助β-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖。首先通过PCR扩增获得异淀粉酶的编码基因iso并克隆入表达载体p HY-WZX,在枯草芽胞杆菌1A717中获得重组质粒p HY-ISO,将构建好的重组质粒电转化入地衣芽孢杆菌D402中,其摇瓶发酵酶活力达330 U/m L,实现了异淀粉酶的异源高效表达。基本酶学特征分析表明:该重组酶适宜反应条件为50~55℃,p H 6.5~9.0;K+、Ca2+、Mg2+对酶活有促进作用,其他离子或化合物强烈抑制酶活。HPLC分析表明,该重组异淀粉酶与普鲁兰酶相比,更有助于极高麦芽糖浆的制备。最后通过在线软件对该酶进行同源结构模拟和分析,进一步确定其为异淀粉酶,为后续对其进行分子改造奠定了基础。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

碳源对枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶的影响

研究可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖3种主要碳源对枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶活力、细菌浊度及其发酵培养过程中培养基pH值变化的影响.结果表明,枯草芽孢杆菌在摇床发酵试验中,当发酵时间超过54 h酶活力基本达到最高且保持不变.以可溶性淀粉为碳源时最佳,枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶酶活力最高为(114.5±2.3) U/mL,细胞浊度为2.342±0.023;其次是葡萄糖和蔗糖,最高酶活分别为(75.6±2.1),(72.2±1.2) U/mL,细胞浊度分别为2.515±0.031,2.421±0.044.可见枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶受淀粉的诱导,受蔗糖及葡萄糖的阻扼作用.     

大麦β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达

该研究拟采用枯草芽孢杆菌异源表达大麦来源β-淀粉酶。选择枯草芽孢杆菌WB800作为宿主,采用同源重组的方法构建表达载体p P4 3NMK-amy B,获得重组枯草芽孢杆菌WB-amy B。重组枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵条件下酶活最高可达386 U/m L,纯化后测得其比酶活为613 U/mg。重组酶的最适温度为55℃,最适p H值为5. 0。重组β-淀粉酶水解产麦芽糖能力与大麦β-淀粉酶相当,与普鲁兰酶联用时麦芽糖最大转化率可达81. 8%。重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵水平产酶量高于类似文献报道,重组β-淀粉酶的酶学性质与大麦β-淀粉酶相比几乎相同,完全可以替代大麦β-淀粉酶在工业上的应用。     

酸性异淀粉酶产生菌的筛选及鉴定

从淀粉厂附近的土壤中分离出产脱枝酶的菌株,通过初筛和复筛,得到1株产偏酸性异淀粉酶活力较高的菌株YDF30。其发酵56h时酶活力最大,达到16．4U/mL。所产生的异淀粉酶最适反应温度为55℃,最适pH值为5．2,在低于50℃和pH5．2～9．6条件下较稳定。依据其形态特征和生理生化实验结果,初步鉴定该菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp．)。     

川西藏区牦牛酸醡肉中产蛋白酶和淀粉酶菌株的分离鉴定及其生理特性分析

实验从川西藏区牦牛酸醡肉中分离获得了7株具有产蛋白酶或淀粉酶的菌株。通过16SrDNA和ITS基因测序鉴定为淀粉液化芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌亚种、植物乳杆菌、戊糖片球菌、镰刀霉、黑曲霉;其中淀粉液化芽孢杆菌、多粘类枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌亚种可同时产蛋白酶和产淀粉酶,且酶活力较高,属于优质发酵菌。     

α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

α-淀粉酶基因经改造后,克隆到穿梭质粒pBE2中。在α-淀粉酶基因的上游连接枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR),构建了含突变α-淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体pBSAT,转化蛋白酶三缺陷枯草芽孢杆菌菌株DB403。含有pBSAT的菌株可将突变α-淀粉酶分泌到胞外,表明sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR)能很好的将枯草芽孢杆菌中的重组α-淀粉酶引导到胞外,完成分泌表达。分泌的α-淀粉酶具有较高的耐酸性及生物学活性。     

重组环糊精葡萄糖基转移酶温控型工程菌的构建及其培养条件的优化

采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）法从蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）中扩增了β-环糊精葡萄糖基转移酶（β-cyclodextrin glucanotransferase,β-CGTase）基因,将该基因克隆到pBV220质粒中,转化E.coli DH5α,经氨苄青霉素抗性筛选和酶切验证后,得到能表达β-CGTase的重组大肠杆菌E.coliDH5α/pBVcgt。通过对工程菌产酶条件的优化,得到最佳产酶条件为：OD600 nm值达到1.0、初始培养温度30 ℃、发酵培养基初始pH 8.0、温度梯度诱导39 ℃培养0.5 h,40 ℃培养0.5 h,41 ℃培养1 h,42 ℃培养2 h。酶活力由优化前的445 U/mL提高到956 U/mL,酶活力提高了1.15 倍。温度梯度诱导比直接诱导酶活力提高20%。该酶的克隆表达以及发酵条件的研究表明,该酶能在大肠杆菌原核表达体系中高效表达。     

碱性芽孢杆菌木聚糖酶基因的克隆及表达

本实验从广西红树林土壤中筛选出一株产木聚糖酶的耐碱菌HSL38,经过16S rDNA鉴定,其与碱性芽孢杆菌Bacillus halodurans C-125(GenBank：NC_002570.2)的同源性达到99%。参考Bacillus halodurans C-125的β-1,4-木聚糖酶基因xynA设计引物,扩增出HSL38中的β-1,4-木聚糖酶基因xyl-BH-G10,其与xynA的同源性达到99%,编码396个氨基酸残基(45.27kD),属于糖基水解酶GH10家族。将xyl-BH-G10基因与表达载体pET-30a-c(+)连接,构建重组载体,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白。结果表明,在最佳诱导条件下,木聚糖酶基因xyl-BH-G10在大肠杆菌细胞内高效表达,酶活力达到55.28U/mL,是原菌株HSL38发酵液酶活力的4倍。     

异甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

以pET-30(a)为表达载体,将来源于枯草芽孢杆菌K-6(Bacillus subtilis K-6)的异甘露聚糖酶基因(isoman K-6)在Escherichia coli BL21(DE3)中进行了表达。Isoman K-6登录号为HQ902141,基因全长为1083bp,共编码360个氨基酸,工程菌酶活为415.9U/mL,SDS-PAGE电泳表明,工程酶ISOMAN K-6分子量约为45000u,与预期分子量相符。经IDAHisBind树脂柱纯化的纯酶酶学性质研究表明,该重组酶为金属酶,Al3+和Ba2+对其有很强的激活作用,其最适反应温度为55℃、最适pH为6.0,且在pH4.5~7之间有着较好的稳定性,以槐豆胶为底物时,Vmax和Km分别为1.3U/mL和7.3mg/mL。     

多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了使新普鲁兰酶基因在大肠杆菌中表达并实现高密度发酵生产,采用PCR方法从多粘类芽孢杆菌基因组DNA中扩增出新普鲁兰酶基因Npu,测序结果表明Npu基因全长2106 bp,编码515个氨基酸,与其他多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因序相似性高达99%。将Npu基因连接到质粒PMD18T上,构建了PMD18T-Npu vecter重组载体。将该重组载体转化到大肠杆菌BL21中,该酶基因在大肠杆菌细胞中获得活性表达,并能将酶蛋白分泌到胞外。重组菌株BL21 PGEX 4T-1-Npu具有较好的遗传稳定性,连续传代培养10代,菌株所产酶总酶活性仍保持在715 U;纯化后的酶液于25 ℃保存6个月酶活性仍保持在5427 U,于4 ℃保存12个月酶活性仍保持在5390.5 U。这是首次对来源于类芽孢杆菌属(paenibacillus)的普鲁兰酶进行报道,由于Npu具有较好的水解淀粉支链的能力,因此其在淀粉加工业以及洗涤业上应用前景良好。     

枯草芽孢杆菌B2(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛.将编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-XYN.初步研究表明:以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程菌摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可迭1542.6 U/mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性.     

多序列比对在克隆表达一株未知芽孢杆菌角蛋白酶基因中的应用

为克隆表达一株未知芽孢杆菌的角蛋白酶基因,本文对芽孢杆菌属来源的13个角蛋白酶基因进行了分类比对,并设计简并引物,成功筛选出一株未知芽孢杆菌的角蛋白酶基因,在大肠杆菌中克隆表达,最后通过SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)分析和酶活测定验证表达成功,同时还确立重组大肠杆菌BL21(pET-28a-Ker)的最佳诱导温度为20℃,经过0.5 mmol/L IPTG (isopropylthio-galactoside)诱导16 h后,粗酶液中的角蛋白酶酶活达到389.7 U/mL。本文证明了通过多序列比对而设计的角蛋白酶简并引物的有效性,且该方法能够简化角蛋白酶的研究和开发。     

牛链球菌L-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

利用PCR方法从牛链球菌(Streptococcus bovis)基因组DNA中扩增出了L(+)乳酸脱氢酶基因(ldh),并将其连接到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSEldh,将重组质粒转化到大肠杆菌菌株JM109。利用SDS-PAGE分析ldh表达产物的分子量为36KD,重组菌株的乳酸脱氢酶酶活力为168.2U/mL,最适反应温度25℃,最适作用pH为5.0,重组质粒的稳定性达99.9%。     

1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD在肺炎克雷伯氏菌中的表达研究

以大肠杆菌(Escherichia coli)基因组为模板,PCR扩增出1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD,经测序确认,将yqhD基因与四环素抗性基因TetR同时插入表达载体pUC18构建重组质粒pUC18-yqhD-TetR,重组质粒转化Klebsiella pneumoniae ME308;37℃,经1.0mmol/LIPTG诱导8h,重组肺炎克雷伯氏菌中1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶的酶活力达到4.16U/mg,而对照菌株的酶活仅为0.62U/mg;将重组菌在摇瓶中进行微氧发酵培养,经IPTG诱导,可将60g/L甘油转化为33.8g/L1,3-丙二醇。     

人乙醛脱氢酶2与NusA的融合表达

通过将乙醛脱氢酶2（acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2）与NusA-tag融合表达,以获得能够在大肠杆菌中可溶性表达并且具有较好活性的重组蛋白。首先,根据Aldh2的基因序列设计引物,引入EcoRI和XhoI的酶切位点,聚合酶链式反应扩增出Aldh2基因片段,连接到pMD19-T-simple载体,并转化到大肠杆菌DH5α菌株。测序正确后,双酶切处理,将Aldh2基因片段克隆到表达载体pET44b（＋）上NusA-tag下游的EcoRI和XhoI酶切位点之间,得到pET44b（＋）-NusA-Aldh2重组载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导,表达的融合蛋白具有良好的溶解性,主要存在于上清液中。融合蛋白的最优表达条件为IPTG浓度0.25 mmol/L、诱导温度37 ℃、诱导时间3 h。重组蛋白的最适反应温度为37 ℃,在pH 7.0时达到最好的催化效果。不同金属离子如Ca2＋、K＋、Na＋、Mg2＋、Mn2＋都对酶有激活作用,且Mg2＋效果最好,最佳的酶活性为1.64 U/mL。而野生型ALDH2在大肠杆菌中表达时完全以无活性的包涵体形式存在,复性后得到的酶活性为1.43 U/mL。本研究通过引入NusA进行融合表达,实现了ALDH2在大肠杆菌中的可溶性表达,且重组蛋白的活性优于包涵体复性蛋白。这些结果表明利用NusA进行融合表达是制备重组ALDH2的一个良好方法。     

解淀粉芽孢杆菌psd基因过表达对胞苷发酵的影响

以解淀粉芽孢杆菌BG-09(Bacillus amyloliquefaciens BG-09)为出发菌株,分析代谢途径中与细胞膜渗透性有关的基因psd,研究过表达基因psd对胞苷发酵的影响。以解淀粉芽孢杆菌BG-09基因组为模板克隆psd,构建了含psd的重组质粒pHT43-psd,通过化学转化法转入菌株大肠杆菌DH5α,验证成功后将其转入B.amyloliquefaciens BG-09,获得重组菌株B.amyloliquefaciens BG-09-psd。将B.amyloliquefaciens BG-09-psd菌株通过摇瓶发酵,研究过表达基因psd对菌体的生长、胞苷和尿苷产量积累的影响。结果显示,重组菌株B.amyloliquefaciens BG-09-psd发酵液中胞苷浓度为1.199 g/L,与对照菌株B.amyloliquefaciens BG-09相比,提高了15.51%,尿苷浓度为0.552 g/L,增加了6.56%,表明过表达基因psd可促进胞苷的积累。