海洋放线菌（Salinispora arenicola）基因转移系统的建立

该实验旨在建立海洋放线菌Salinispora arenicola基因转移系统,以便基因敲除和外源基因表达等遗传操作。以整合型质粒pSET152和pIB139为出发质粒,通过接合转移构建了海洋放线菌Salinispora arenicola的基因转移系统。结果表明,25 μg/mL阿泊拉霉素可有效筛选接合子,大肠杆菌与孢子的比例为8∶1时可获得较多的转化子。经聚合酶链式反应（PCR）验证,质粒成功整合到菌株海洋放线菌S. arenicola基因组中,接合子经多次传代后,导入的质粒pSET152和pIB139仍稳定整合于接合子基因组上。成功构建了海洋放线菌S. arenicola接合转移系统。     

海洋放线菌酰基转移酶基因的克隆

对稀有海洋放线菌酰基转移酶进行基因的克隆得到目的片段。先设计两对酰基转移酶特异性引物,以总DNA为模板,然后通过PCR扩增的方法得到酰基转移酶的完整的基因片段,并将该片段插入载体p UC18中,以酶连的方法对重组质粒进行酶切,得到的片段进行验证,成功地获得了稀有海洋放线菌酰基转移酶的基因片段。     

重叠延伸PCR克隆拟南芥ACCase基因和植物表达载体构建

植物的乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A,是脂肪酸合成的第一步,该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成的关键调控步骤。拟南芥中的真核形式ACCase基因cDNA长约7000bp,难以直接克隆。本研究先通过常规PCR将其cDNA分成八个重叠的片段分别扩增出来,再用重叠延伸PCR将得到的片段逐步拼接成长度为6890bp的完整的基因序列,测序证实克隆序列正确无误,最后将其克隆到农杆菌转化植物的载体上。序列分析发现ACCase基因的开放阅读框长度为6765bp,编码一个含2254个氨基酸残基的多肽链,推测其分子量约为250kDa。ACCase基因的成功克隆为利用该基因调控油料作物的含油量奠定了良好基础,同时为克隆长度较大的基因提供了一种经济可行的方法。     

CODEHOP法设计引物克隆色盐杆菌ST307胆碱脱氢酶基因及其序列分析

目的研究色盐杆菌ST307甜菜碱的合成,克隆分析其胆碱脱氢酶betA基因片段。方法采用醇提法提取色盐杆菌ST307中的甜菜碱并检测,用CODEHOP在线程序设计简并引物扩增胆碱脱氢酶betA基因序列,并进行序列分析。结果色盐杆菌ST307细胞中积累甜菜碱,通过PCR获得长度为485 bp的betA基因片段。BLAST序列分析显示该基因序列与多个菌株的betA基因序列具有较高的同源性,最高达83%。核苷酸序列比对及进化树构建结果显示,色盐杆菌ST307胆碱脱氢酶基因序列与Pseudomonas fulva 12-X进化关系最为接近。结论 CODEHOP法设计的简并引物可信性较强,同时betA基因片段的成功克隆将为获得ST307胆碱脱氢酶基因的全序列、研究耐盐机制和遗传改良提供科学依据。     

DNA聚合酶基因pfu的克隆及初步表达

通过分子克隆技术从嗜热极端微生物Pyrococcus furiosus中克隆出高热稳定性的pfuDNA聚合酶基因,琼脂糖凝胶电泳显示基因片段的长度为2.3kb,将其转化入大肠杆菌中并获得初步表达.重组酶成功地扩增了800bp的DNA片段.     

变形假单胞菌吡咯喹啉醌合成基因簇的克隆与分析

从变形假单胞菌JUIM01中克隆到吡咯喹啉醌(PQQ)合成基因簇,阐明了其基因组成和生物学信息。根据已报道的假单胞菌的基因组进行简并引物设计,采用LA-PCR技术克隆变形假单胞菌的PQQ合成基因簇,对克隆的基因片段进行测序并使用生物信息学方法进行综合分析。结果表明:克隆到的基因片段全长为11 659 bp,其中包括pqqF、pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqM、pqqH和pqqI共9个基因,编码PQQ生物合成的前体短肽PqqA和合成途径的相关酶;这些基因与荧光假单胞菌Pf0-1的PQQ合成基因簇的基因组成类似,相应基因的序列一致性达41%～94%。本研究中首次从变形假单胞菌中克隆到PQQ合成基因簇,并对其进行生物信息学分析,为变形假单胞菌的PQQ生物合成途径和胞内再生机制的研究奠定了基础,进而为提高2KGA的生产强度提供了理论支撑。     

油菜脂酰CoA合成酶基因pXT166的鉴定和功能分析

长链脂酰CoA合成酶（LACSs）在脂肪酸的合成代谢与分解代谢中起着重要的作用,它把游离脂肪酸活化为脂酰CoA硫酯。pXT166经证实具有编码长链脂酰CoA合成酶活性。本研究通过酵母互补实验验证了pXT166具有LACS的酶活性。分析该基因编码蛋白的底物偏好性显示,长链饱和脂肪酸是其优先底物。RT—PCR分析表明,在不同油脂含量的油菜品系种子中,授粉后35d,该基因在高含油量的种子中表达更强,表明pXT166参与了油菜种子中油脂的合成,与种籽含油量相关。     

双孢蘑菇耐热相关基因028-1的克隆与序列分析

根据双孢蘑菇耐热相关基因片段028-1400的cDNA序列设计并合成引物，应用cDNA末端快速扩增（RACE）方法获得该基因的5′端cDNA片段028-11200。以上述两个片段为模板，经PCR扩增获得该基因的全长cDNA序列，并对其进行了克隆、鉴定、测序与分析。该序列全长1．37Kb，在GenBank中未发现明显的同源序列。该基因序列在GenBank上的登录号为DQ235473。     

花生Ara h6基因的克隆、表达以及免疫活性鉴定

目的:克隆花生主要过敏原Arah6基因,诱导表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法:提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Arah6的基因,将测序正确的片段连入原核表达载体pET-28a上,并转入BL21（DE3）宿主表达菌中,IPTG诱导表达,通过Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白,Western-blotting检测该重组蛋白的免疫原性。结果:测序结果表明花生Arah6目的片段全长为438bp,编码145个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同。该基因诱导表达的产物纯化后经SDS-PAGE鉴定为17kDa。Western-blotting结果表明该蛋白与花生过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性。结论:成功克隆花生过敏原Arah6的基因,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。      

简并引物法克隆保加利亚乳杆菌β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因

β-N-乙酰氨基己糖苷酶-β-Hexcase-在细菌、植物和动物中广泛存在,具有典型的外切酶活性并可以催化切除β-N-乙酰氨基己糖的非还原性氨基己糖残基,在细菌细胞分裂中具有重要作用. 选取与保加利亚乳杆菌LJJ亲缘关系近的菌种的β-N-乙酰氨基己糖苷酶蛋白序列,利用ICODEHOP和CODEHOP在线简并引物设计软件设计β-Hexcase简并引物,选取Hex1-f和Hex1-r引物对,以LJJ基因组DNA为模板经PCR扩增得到614bp产物. PCR产物连接pGEM-T质粒载体后克隆至大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆提取质粒进行测序. 测序结果显示产物长度为614bp,该DNA序列经blastx比对发现与其他已知β-Hexcase基因具有相似性,表明所克隆的序列即为LJJ β-Hexcase的基因片段. β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因的获得为进一步研究β-N-乙酰氨基己糖苷酶与保加利亚乳杆菌自溶的关系奠定了基础.     

解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)源唾液酸醛缩酶基因的异源表达及其活性研究

为发掘新型唾液酸醛缩酶,使其在大肠杆菌中得到高效表达,本研究首次从菌株Pedobacter heparinus中克隆疑似编码唾液酸醛缩酶的PhNeuLy3300基因片段,并构建可自主表达异源蛋白的组成型表达载体pRSF-EM5。在此基础上将克隆的目的基因分别导入该pRSF-EM5载体和常用的诱导型载体pET-30a,构建重组质粒pET30a-PhNeuLy3300和pRSF-EM5-PhNeuLy3300,经大肠杆菌表达系统异源表达目的蛋白,并进一步对两种重组蛋白酶进行电泳分析和活性研究。结果表明:编码唾液酸醛缩酶的基因片段全长为945 bp,共编码314个氨基酸残基;聚丙烯酰胺凝胶电泳显示两种重组蛋白表观分子量约为36.4 kDa,纯化后的pET30a-PhNeuLy3300重组蛋白浓度为3.29 mg/mL,证明经异源表达获得了两种重组目的蛋白酶;活性研究显示两种重组唾液酸醛缩酶均能在1 h内催化N-乙酰神经氨酸生成N-乙酰甘露糖胺,证明两种重组蛋白酶均具有较高的活性。     

烟草侧芽生长相关基因克隆及RNAi载体的构建转化

为了培育打顶后不长侧芽的烟草植株,通过同源克隆,在烟草(品种K326)中得到了与侧芽生长相关基因的1个片断,将该片段序列通过BLAST检索Genbank同源比对,发现该基因同番茄的LS基因有非常高的同源序列,另外与水稻的MOC基因、拟南芥的LAS基因也有一定的同源性,命名为TLR基因.将TLR基因阅读框内640 bp的正向和反向片断构建到RNAi载体pHANNIBAL内含子两侧,再经NotI酶切回收约4300 bp目的片段,并插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含TLR基因片段正反向重复序列的植物表达载体pHANNIB AL-TLR-P ART27.将pHANNIB AL-TLR-P ART27质粒导入根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,没有得到转基因再生植株,推测这与TLR基因表达被抑制有关.     

三种呈味肽串联基因的构建和表达

通过对呈味肽GD、AD、VD结构的分析,引入甲酸和胰蛋白酶的专一性位点,设计了呈味肽的串联单体。根据大肠杆菌偏嗜密码子设计并合成寡核苷酸片段,利用拼接法合成此三种肽的8拷贝片段,将其克隆至表达载体pET-30a并转化到宿主菌BL21（DE3）中。筛选的阳性克隆经测序表明,本研究已成功构建了重组呈味肽工程菌BL21-pET30-8GD、BL21-pET30-8AD、BL21-pET30-8VD。IPTG诱导的菌体总蛋白和破碎液上清的纯化物经Tricine-SDS-PAGE电泳检测,证明目的基因得以成功表达。      

大豆主要过敏原β-伴大豆球蛋白β亚基的抗原表位分析及分段克隆

利用生物信息学软件SWISS-MODEL对大豆主要过敏原β-伴大豆球蛋白β亚基建立出三级结构模型,并根据Disco Tope 2.0服务器预测出该模型的构象表位相关区段,采用分段克隆方式扩增目的基因的3个片段区域,利用PCR技术扩增目的基因全长及3个互相重叠的片段（A、B、C）将其连接至p MD18-T载体,并转化到大肠杆菌感受态JM109。经蓝白斑筛选,以及对重组质粒进行PCR和双酶切验证,测序结果与设计的基因序列一致,成功得到了目的基因片段的阳性克隆子,为β-伴大豆球蛋白β亚基分段表达及抗原区域位置的筛选与鉴定提供参考。      

甘油激酶的表达纯化及在酮糖合成中的应用

研究了大肠杆菌MG1655来源的甘油激酶(GK)的表达及其在酮糖合成中的应用。本研究从大肠杆菌MG1655扩增了甘油激酶的基因片段glpK,连接到表达载体pET-28a上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达,利用Ni~(2+)亲和层析柱纯化目的蛋白。利用该甘油激酶可以催化成本较低的底物甘油生成L-3-磷酸甘油,再经过磷酸甘油氧化酶(GPO)的催化生成磷酸二羟基丙酮(DHAP),生成的DHAP可以在不同的DHAP依赖性醛缩酶的催化下与受体D-甘油醛合成酮糖-1-磷酸,最终用酸性磷酸酶脱掉磷酸生成一系列酮糖。结果表明,该酶成功地用于"一釜多酶法"合成体系中,以便宜的底物甘油为前体,合成出包括稀有糖在内的一系列酮糖,生成的产物、产率及比例用TLC、HPLC进行检测。该方法的建立将为其他稀有糖及其衍生物的合成提供理论依据。     

假单胞菌SP-6胞外弹性蛋白酶基因的克隆与表达

以分离筛选、鉴定的假单胞菌为研究材料,提取假单胞菌的基因组为模板基因,设计引物进行PCR扩增.扩增的条件为94℃预变性4min,98℃变性10 s,58℃退火1min,72℃延伸2min,35个循环,72℃复性10min.用试剂盒回收PCR产物,以PGEM-T Easy Vector为载体,产生重组质粒,转化到大肠杆菌(E.coli)JM109细胞中,于LB平板上进行蓝白筛选阳性克隆.提取阳性克隆的质粒,电泳筛选滞后质粒,EcoRⅠ酶切验证后进行测序,检测弹性蛋白酶基因在JM109 E.coli细胞中的表达.结果表明PCR扩增出1.67 kb的基因片段,并成功克隆在E.coliJM109细胞中;挑取白斑提取的质粒,检测有滞后质粒,EcoR Ⅰ酶切检测到3.0 kb的载体和1.67 kb的基因片段;以滞后质粒为模板再次进行PCR扩增,扩增出1.67 kb基因片段,证明该质粒为重组质粒,经上海博亚生物技术公司测序为1.67 kb的基因片段,并在E.coliJM109细胞中表达.     

利用重组枯草芽孢杆菌L-氨基酸连接酶合成丙谷二肽

利用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE 3)克隆并表达来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC 15245的L-氨基酸连接酶(L-amino acid ligase,Lal)基因,采用Ni-NAT亲和层析法分离纯化得到重组的Lal,并以L-丙氨酸和L-谷氨酰胺为底物制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(丙谷二肽).Lal属于ATP依赖酶,研究结果表明其最适反应温度和pH值分别为37℃和9.0,连续催化反应14 h可催化等摩尔的底物氨基酸(30 mmol/L)生成22.4 mmol/L的丙谷二肽,最高摩尔转化率可达74.7％.成功克隆表达了枯草芽孢杆菌的L-氨基酸连接酶,并将其应用于丙谷二肽的酶法合成,研究结果可为丙谷二肽的生物制造奠定理论基础.     

重组鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽融合基因分子设计及大肠杆菌表达载体构建

[目的]:为了获得一种能同时对高血压和骨质疏松两种疾病有治疗作用的融合蛋白.[方法]:根据大肠杆菌偏爱密码子原则,采用基因工程的方法设计并合成了重组降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因,并将该基因克隆到pGEX-6P-1表达载体上,将重组质粒转化到BL21中表达.[结果]:通过DNA测序验证目的基因被正确克隆到pGEX-6P-1上.[结论]:大肠杆菌表达栽体构建成功.     

乙酰辅酶A含量对酿酒酵母乙酸乙酯合成的影响

通过缺失乙酰辅酶A水解酶（ACH）基因和过表达乙酰辅酶A合成酶（ACS）基因技术提高酿酒酵母合成乙酰辅酶A（acetyl- CoA）能力的同时,过表达醇酰基转移酶（ATF）基因,提高乙酸乙酯合成能力,并考察acetyl-CoA含量对酿酒酵母合成乙酸乙酯能力的影响。结果表明,敲除ACH1基因、且在敲除ACH1基因基础上过表达ACS1、ACS2基因均能提高酿酒酵母Acetyl-CoA含量,进而提高乙酸乙酯含量。较亲本菌株α5,缺失突变株α5ΔACH1、重组菌株α5-A1、α5-A2的Acetyl-CoA的含量均分别提高了52.5%、80.33%、52.79%,乙酸乙酯含量分别提高10.59%、26.12%、23.70%。在敲除ACH1基因、过表达ACS1和ACS2基因的基础上同时过表达ATF1基因,得到工程菌株A1-ATF1和A2-ATF1,较亲本菌株α5,乙酸乙酯含量分别提高226.09%、530.43%、289.57%,工程菌株A1-ATF1乙酸乙酯产量最高,为72.52 mg/L。研究表明,提高乙酰辅酶A含量能够促进乙酸乙酯的合成,为提高乙酸乙酯生成量提供了新思路。     

应用微量测压技术测定黑曲霉柠檬酸发酵菌株对蔗糖和柠檬酸盐的呼吸作用

<正> 在应用甘蔗或甜菜糖蜜为原料,以黑曲霉为发酵菌株,深层发酵制柠檬酸的工业生产中,由于糖蜜中各种杂质特别是铁含量较多,对柠檬酸发酵带来不利的影响。根据三羧酸循环机制,葡萄糖经EMP途径酵解生成丙酮酸,丙酮酸经脱羧与CoA生成乙酰CoA,同时丙酮酸经二氧化碳暗固定即羧化为草酰乙酸,乙酰CoA与草酰乙酸在柠檬酸缩合酶的作用下合成柠檬酸,如图1。在这样十分理想的情况下,发酵培养基中的葡萄糖