卵黄高磷蛋白对壳聚糖膜基质上MC3T3-E1细胞增殖的影响

本研究制备了壳聚糖和氧化石墨烯/壳聚糖复合膜,并采用CCK-8法、Annexin V/PI双染法和PI染色检测了蛋黄中提取的卵黄高磷蛋白对MC3T3-E1细胞在该复合膜基质上的生理活动的影响。结果表明:壳聚糖膜对细胞无毒性影响,并通过提高S期细胞所占比例,使MC3T3-E1细胞活性提高了31.92%,抑制细胞凋亡,使凋亡率下降45.78%;氧化石墨烯/壳聚糖膜会提高细胞的凋亡率,氧化石墨烯含量越高,促进凋亡越明显,凋亡率在氧化石墨烯含量为2%时最高,为17.64%;在壳聚糖膜基质上,100 μg/mL卵黄高磷蛋白对MC3T3-E1细胞促进增殖作用最显著(p<0.05),细胞活性提高81.59%,同时降低了细胞的凋亡比例;蛋白浓度为500 μg/mL时,细胞活性下降4.47%,促进了细胞凋亡。综上所述,壳聚糖和低浓度卵黄高磷蛋白均能提高MC3T3-E1细胞的活性。     

鱿鱼皮胶原蛋白水解肽对镉抑制MC3T3-E1增殖、分化及钙化的影响

目的:探究秘鲁鱿鱼皮胶原蛋白水解肽增强MC3T3-E1细胞抗骨质疏松的作用。方法:将培养的MC3T3-E1细胞分为正常对照组、氯化镉损伤组和胶原蛋白水解肽干预组;利用MTT法确定氯化镉的半数抑制浓度,建立细胞损伤模型;根据各组细胞增殖率差异,确定最佳胶原蛋白水解肽的添加量;通过细胞周期、凋亡,碱性磷酸酶活性的测定及Alizarin red染色法分析胶原蛋白水解肽在细胞增殖、分化、钙化阶段拮抗氯化镉的抑制作用。结果:与氯化镉损伤组相比,胶原蛋白水解肽干预组细胞活性升高(P0.01);处于G1期的细胞数量减小(P0.05),S期细胞数量增大(P0.05);凋亡率降低(P0.05);9,12,15 d时AKP活性升高(P0.05,P0.01,P0.01)。结论 :摄入一定剂量的氯化镉会抑制MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和钙化。胶原蛋白水解肽在一定程度上可改善此类损伤对MC3T3-E1细胞的影响。     

鸡蛋黄蛋白质水解产物制备及其对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

鸡蛋黄经脱脂得到蛋黄蛋白质,直接以MC3T3-E1细胞增殖活力为指标,对水解条件进行优化,从而制备蛋黄蛋白质水解产物(egg yolk proteins hydrolysate,EYPH)并对其促MC3T3-E1细胞增殖分化的活性进行研究。结果表明:在对比胰蛋白酶与风味蛋白酶水解过程中,发现单一胰蛋白酶反应得到产物活性最好,胰蛋白酶反应的最佳水解条件为水解时间6 h、水解温度37℃、酶与底物质量比1∶50、p H 8.0。EYPH使MC3T3-E1细胞增殖活力得到提高,为129.89%,细胞周期分析得到S期细胞增加了4.69%,这2个方面证实EYPH对MC3T3-E1细胞的增殖活力有显著的提高。EYPH对MC3T3-E1细胞分化矿化有显著影响,碱性磷酸酶活力提高了9.1%;刺激骨钙素分泌,其含量上升2 mg/mL;形成更多的矿化结节。此外,EYPH还能刺激RUNX2特异性转录因子的基因表达,表达量提高了6.12倍。结果说明EYPH对成骨细胞MC3T3-E1增殖分化有显著的促进作用,因此,EYPH对于抗骨质疏松方面有较好的应用潜力,为开发其功能性食品提供一定的数据参考。     

罗非鱼鱼鳞胶原蛋白水解物对成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响

目的:研究罗非鱼鱼鳞胶原蛋白水解物(tilapia fish scale collagen hydrolysate,FH)对小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1的增殖和分化的影响。方法:采用噻唑蓝法测定MC3T3-E1细胞的增殖率,用p-nitrophenyl phosphate(p-NPP)法测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的活性,Elisa酶联免疫法检测Ⅰ型胶原蛋白(Collagen type Ⅰ,Col Ⅰ)和骨钙素(Osteocalcin,OCN)的分泌量,茜素红染色法测定细胞外基质矿化结节的数量。结果:与空白对照组相比,FH对细胞的增殖性没有显著的促进作用,但是可以显著提高细胞ALP活性,促进Col Ⅰ和OCN的分泌。此外,FH可以促进细胞矿化结节的生成。结论:FH通过促进成骨细胞MC3T3-E1分化和矿化来提高骨的形成,对开发抗骨质疏松症和骨关节炎等疾病的功能性食品有重要的意义。     

响应面法优化龟甲蛋白提取工艺及其对MC3T3-E1细胞增殖活性

目的:优化龟甲蛋白提取工艺,筛选龟甲促成骨细胞（MC3T3-E1）增殖活性组分。方法:以蛋白含量及对MC3T3-E1细胞增殖率为指标筛选龟甲蛋白提取方法;以料液比、提取温度、时间为自变量,龟甲蛋白含量为因变量,进行单因素提取研究,结合响应面试验设计,获得提取龟甲蛋白最佳工艺;通过超滤技术将龟甲蛋白按分子量分为5个不同组分:总提组分（组分1）,Mw>10 kDa组分（组分2）,Mw:3~10 kDa组分（组分3）,Mw:1~3 kDa组分（组分4）,Mw<1 kDa组分（组分5）,CCK8法测定不同浓度龟甲蛋白（12.5、25、50、100、200 μg/mL）及其不同组分对MC3T3-E1细胞增殖率的影响。结果:磁力搅拌方法得到的龟甲蛋白含量最高,且活性最佳,龟甲蛋白最佳提取条件为料液比1:13（g/mL）、提取温度30℃、提取3 h,此条件下测得龟甲蛋白含量为15.16%;龟甲蛋白不同组分均能促进MC3T3-E1前成骨样细胞增殖,并呈浓度依赖性,在浓度为200 μg/mL时,组分1~5对细胞的增殖率分别为20.58%、25.30%、30.24%、37.89%、38.15%,分子量小于1 kDa的组分促MC3T3-E1细胞增殖活性最佳。结论:本研究为龟甲蛋白的制备工艺提供参考,并证明龟甲蛋白及其不同组分均具有较好的促成骨细胞增殖活性,其中分子量小于1 kDa组分对MC3T3-E1细胞增殖的效果最佳。     

鱿鱼皮胶原蛋白对H_2O_2诱导MC3T3-E1损伤的修复作用

目的:探究秘鲁鱿鱼皮胶原蛋白增强MC3T3-E1细胞抗自由基损伤的作用机制。方法:将培养的MC3T3-E1细胞分为正常对照组、H2O2损伤组和胶原蛋白干预组;利用MTT法确定H2O2的半数抑制浓度,建立自由基损伤的细胞模型,通过试剂盒测定SOD活性和MDA含量来确定最佳的胶原蛋白添加量;在倒置显微镜下观察各分组的细胞形态;用流氏细胞仪检测细胞凋亡率,并分析细胞增殖周期;实时荧光定量RT-PCR测定HSP70和Bax的表达水平。结果 :与H2O2损伤组相比,胶原蛋白干预组SOD活性升高(P0.05),MDA含量降低(P0.05),凋亡率降低(P0.05),G0-G1期细胞百分率减小(P0.05),S期细胞百分率增大(P0.05),Bax表达减弱,HSP70表达增强(P0.05)。结论:摄入一定剂量的H2O2会导致MC3T3-E1成骨细胞的氧化损伤并促进其凋亡,而胶原蛋白可以改善此类损伤对MC3T3-E1细胞的影响。     

酶解牛骨肽促进骨骼生长功效的研究

采用低钙鼠粮饲喂Wistar大鼠,造大鼠低钙模型,口服给予模型组大鼠酶解牛骨肽3个月,研究酶解牛骨肽对低钙大鼠促进骨骼生长的作用,测定各实验组大鼠体重指数以及大鼠股骨重量、股骨强度、骨钙含量及血清钙离子含量等多项生理生化指标,同时做体外细胞实验,研究酶解牛骨肽对成骨细胞MC3T3-E1增殖情况的影响。结果表明:酶解牛骨肽对低钙大鼠骨钙含量水平的升高有明显作用(P 0.05),酶解牛骨肽可以在体外促进成骨细胞MC3T3-E1的增长,说明酶解牛骨肽在一定程度上能够促进骨骼生长发育。     

鲫鱼卵唾液酸糖肽对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化及OPG/RANKL基因表达的影响

目的:研究鲫鱼卵唾液酸糖肽(Ca-SGPP)对成骨细胞MC3T3-E1骨形成活性及OPG/RANKL基因表达水平的影响。方法:在MC3T3-E1细胞中加入不同浓度的Ca-SGPP,采用MTT法、试剂盒和茜素红染色法检测Ca-SGPP对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响;利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测MC3T3-E1细胞骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨保护素(OPG)及核因子κB受体活化因子配体(RANKL)基因m RNA表达水平。结果:Ca-SGPP可显著促进MC3T3-E1细胞增殖及ALP、OCN和COL I的分泌,提高MC3T3-E1细胞矿化能力,上调其BMP-2表达水平及OPG/RANKL的比值,且分子质量大的糖肽效果更佳。结论 :CaSGPP具有促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的能力,其机制可能与OPG/RANKL比值上调有关。     

牛骨肽钙螯合物制备、表征及其促MC3T3-E1细胞成骨活性

目的：为制备人体高效吸收利用的补钙剂并探究其对MC3T3-E1细胞成骨活性的影响。方法：对牛骨多肽进行钙螯合处理，以钙螯合能力为考察指标，通过响应面方法确定最佳制备条件；利用红外光谱、X射线衍射和原子吸收等方法探究肽钙螯合物的结构特性及其稳定性；通过细胞实验探究牛骨肽钙螯合物对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化活性的影响。结果：制备牛骨肽钙螯合物的最佳条件为肽钙质量比2.97∶1、温度62.54℃、pH 9.06。在该条件下，钙螯合能力达到55.65 μg/mg。光谱结构分析结果表明氨基氮、羟基氧和羧基氧是钙主要螯合位点，二者之间主要通过配位键结合，且肽螯合钙后分子质量增加；此外，牛骨肽钙螯合物稳定性受温度影响较小，但对pH值较敏感。MC3T3-E1细胞实验结果表明肽钙螯合物具有明显促MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化活性的作用。结论：制备的牛骨肽钙螯合物具有潜在的促MC3T3-E1细胞成骨活性功效。     

卵黄高磷蛋白磷酸肽及其钙螯合物在双细胞共培养体系中对成骨细胞分化的促进作用

研究了卵黄高磷蛋白磷酸肽（Phosvitin Phosphopeptide,PPP）及其钙螯合物（PPP-Ca）在成骨细胞（MC3T3-E1）和破骨前体细胞（RAW264.7）共培养体系中对成骨细胞分化的调节作用。对细胞毒性、碱性磷酸酶（AKP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的活性和TRAP染色进行分析;用RT-PCR技术进一步探究成骨细胞RANKL/OPG通路相关蛋白的mRNA表达情况。结果发现,PPP和PPP-Ca可以使MC3T3-E1体系中的AKP活性分别增加9.5%和12.7%;PPP和PPP-Ca的加入可以使MC3T3-E1体系中OPG基因mRNA的表达量从0.92分别提升至1.25和1.39、使RANKL基因mRNA的表达量从1.00分别提升至1.23和1.45。该研究结果表明,PPP和PPP-Ca可有效促进成骨细胞的分化。实验结果为进一步探索磷酸肽在多细胞模型体系中的作用提供了研究基础,同时为磷酸肽的功能活性开发提供理论依据。     

鲫鱼卵唾液酸糖蛋白制备工艺优化及其促骨形成作用研究

以14种水产动物卵为原料,筛选出具有较高促前成骨MC3T3-E1细胞增殖活性的鲫鱼卵水溶性糖蛋白,采用响应面法优化了鲫鱼卵唾液酸糖蛋白(Sialoglycoprotein of Carassius auratus eggs,Ca-SGP)的提取工艺,并评价Ca-SGP对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响。结果表明,14种水产动物卵中,鲫鱼卵糖蛋白唾液酸含量最高,且对MC3T3-E1细胞增殖率最高,分别为5.76%和145.71%;采用单因素和响应面试验优化得到制备Ca-SGP的最优提取工艺为:NaCl浓度为0.38 mol/L、提取时间为4.2 h、液料比为1:3.88 w/v,在此条件下,Neu5Ac得率的预测值为592 mg/100 g,验证值为588.47 mg/100 g。Ca-SGP对骨形成作用的研究结果表明,Ca-SGP显著提高MC3T3-E1细胞增殖至135.56%,显著提高COL I、OCN和OPN的分泌量,分别提高到32.23、261.46和85.89 ng/mL,显著提高成骨细胞矿化能力至241.67%,说明Ca-SGP具有显著促骨形成作用(P<0.05)。以上研究为寻找安全、有效抗骨质疏松功能因子提供新途径。     

响应面法优化鹿鞭肽酶解工艺及体外补肾健骨活性分析

目的：确定碱性蛋白酶酶解鹿鞭肽最佳工艺条件,并探究其体外补肾健骨活性。方法：以酶解温度、pH、酶解时间和酶用量为影响因素,水解度为响应指标,在单因素实验的基础上,结合Box-Behnken方法进行响应面试验设计,获得酶解鹿鞭肽的最佳工艺;探究不同浓度的鹿鞭肽对小鼠睾丸间质细胞（TM3）的存活率以及睾酮（Testosterone,T）的分泌影响和对成骨细胞（MC3T3-E1）的存活率、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活力以及骨钙素（Osteocalcin,OCN）的分泌影响。结果：最佳酶解工艺条件为温度51℃,pH8.7,时间4.1 h,酶用量1300 U/g,此时水解度为40.36%±0.22%;体外活性实验结果表明,TM3细胞不同浓度（25、50、100、200μg/mL）给药组与模型组相比较,均可显著提高细胞存活率和睾酮的分泌（P<0.05）,并在50μg/mL质量浓度下,鹿鞭酶解肽对TM3细胞的T分泌促进作用最强,其分泌量为42.47 ng/mL;MC3T3-E1细胞不同浓度（25、50、100、200μg/mL）给药组与模型组相比较,细胞存活...     

Activities of MC3T3-E1 cells cultured on gamma-irradiated salmon atelocollagen scaffold

We investigated the effect of gamma-irradiation on the activities of MC3T3-E1 cells cultured on gamma-irradiated salmon atelocollagen (SAC) scaffolds. SAC-cultured samples were irradiated at doses of 10, 15, and 25 kGy. Gamma-irradiation had a significant impact on the activities of MC3T3-E1 cells. The proliferation rates and alkaline phosphatase activities of MC3T3-E1 cells increased with gamma-irradiation dose.     

鲫鱼卵唾液酸糖蛋白化学结构分析及对前成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响

目的：成熟的鲫鱼卵经提取、分离纯化得到唾液酸糖蛋白（sialyglycoproteins of Carassius auratus eggs,CA-SGP）,分析其化学结构,及对前成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响。方法：采用水提法从成熟鲫鱼卵中提取水溶性蛋白,经阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱分离纯化鲫鱼卵水溶性蛋白得到CA-SGP,测定其基本组成,采用高效凝胶液相色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子质量和纯度,PMP柱前衍生高效液相色谱法测定其单糖组成;采用噻唑蓝法测定MC3T3-E1细胞的增殖率,酶联免疫法测定Ⅰ型胶原蛋白（collagen type Ⅰ,COLⅠ）和骨钙素（osteocalcin,OCN）的分泌量及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的活性,茜素红染色法测定矿化结节的数量。结果：得到单一的组分CA-SGP,在高效凝胶过滤色谱色谱图上呈现单一的糖和蛋白的检测重叠峰,在凝胶电泳图上呈现单一弥散性条带,其蛋白质含量为14.33%,己糖含量为62.81%,N-乙酰神经氨酸（N-acetylneurainic acid,Neu5Ac）含量为19.72%。单糖组成测定结果显示：CA-SGP主要由甘露糖、葡萄糖胺、半乳糖胺组成,其物质的量比为7.61∶6.70∶1.00;MC3T3-E1细胞与CA-SGP共同孵育后,其增殖率显著增加,COLⅠ和OCN的分泌量分别增加了39.28%和83.06%,ALP活性提高了285.08%,矿化结节的数量增加了96.41%,说明CA-SGP显著促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化。结论：CA-SGP为富含Neu5Ac的糖蛋白,具有显著促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的作用,对开发抗骨质疏松功能性食品具有重要意义。     

巴戟天多糖的理化性质及其对成骨细胞MC3T3-E1增殖的影响

以巴戟天为原料,通过酶辅助浸提法提取多糖,采用化学和仪器分析法研究多糖的pH、相对黏度、溶解性、光谱特征、空间构像等理化性质,采用噻唑蓝法测定MC3T3-E1细胞增殖率,酶联免疫法测定Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ,COLⅠ)和骨钙素(osteocalcin,OCN)分泌量及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,评价多糖提取物对成骨细胞增殖的影响。结果表明,巴戟天多糖属于酸性多糖,pH为6.15±0.13,相对黏度为1.26±0.12,具有糖的特性和三股螺旋结构,溶解性较好,不含蛋白质或多肽;巴戟天多糖提取物浓度为50 μg/mL时,MC3T3-E1细胞增殖率极显著增加(P<0.01),达149.67%,COLⅠ和OCN的分泌量极显著增加(P<0.01),分别增加44.98%和85.01%,ALP活性极显著提高(P<0.01),提高了258.95%。表明巴戟天多糖提取物能显著促进MC3T3-E1细胞增殖与分化。