婴幼儿配方乳粉加工环境中蜡样芽孢杆菌多位点序列分型

以分离自婴幼儿配方乳粉加工环境中蜡样芽孢杆菌为研究对象,利用多位点序列分型(MLST)技术对蜡样芽孢杆菌的多样性和系统进化关系进行探究。结果表明,84株蜡样芽孢杆菌共分成24个ST型,分别是ST-24、ST-26、ST-32、ST-62、ST-144、ST-374、ST-999、ST-1119、ST-1243、ST-1284、ST-1333、ST-1334、ST-1335、ST-1336、ST-1337、ST-1338、ST-1339、ST-1340、ST-1341、ST-1342、ST-1343、ST-1344、ST-1345及ST-1347,其中ST-999(22.62%)、ST-1343(15.48%)、ST-1335(7.14%)与ST-1345(7.14%)是该婴幼儿配方乳粉加工环境中的优势ST型。同时发现了3个新的等位基因pur-242,pyc-198,ilv-276与14个新的ST型ST-1333、ST-1334、ST-1335、ST-1336、ST-1337、ST-1338、ST-1339、ST-1340、ST-1341、ST-1342、ST-1343、ST-1344、ST-1345和ST-1347。系统发育分析表明24个ST型与B.cereus、B.anthracis和B.thuringiensis这三个种显示了更近的系统发育关系,与蜡样芽孢杆菌群体中的另外8个种的亲缘关系较远。     

基于全基因组测序的蜡样芽孢杆菌食品分离株分子特征及耐药性研究

目的 研究上海市食品中分离的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因组特征及其耐药性。方法 本研究对上海市食品中分离的蜡样芽孢杆菌进行鉴定、药物敏感性实验和全基因组测序,利用BioNumerics软件对测序数据进行拼接组装,利用拼接数据进行多位点序列分型(MLST)、毒力基因和耐药基因分析,并与PubMLST数据库中的ST型进行比较;对耐药基因和耐药表型进行比较分析。结果 本研究中37株蜡样芽孢杆菌均可分型,其中7株为ST新型。37株蜡样芽孢杆菌分为34个ST型,其中3株菌为ST26型,其余ST型各占1株,呈高度多样性。37株蜡样芽孢杆菌均携带nheA、nheB、nheC基因,hblACD基因簇的携带率为37.8%,而完整ces呕吐基因簇的携带率只有16.2%,其中2株为分离自即食食品的ST26型。药敏实验显示37株蜡样芽孢杆菌对氨苄西林、青霉素和苯唑西林耐药性较高,与其携带耐药基因种类并不完全一致。结论 上海市食品中分离的蜡样芽孢杆菌菌株分子分型呈现高度多样性,应加强食品中蜡样芽孢杆菌分子生物学监测,为预防控制由其引起的食源性疾病提供科学依据。     

蜡样芽孢杆菌ERIC-PCR分子分型方法的建立

为建立简单快速的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)基因间重复共有序列PCR(ERIC-PCR)的分子分型方法,该研究以B.cereusCMCC 63303的基因组DNA为模板,并采用正交设计L16(45)对影响ERIC-PCR反应体系的五个因素(模板DNA、Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物)在四个浓度水平上进行优化,并通过单因素试验确定最佳退火温度,最后以优化后的反应体系对50株B.cereus分离株进行ERIC-PCR分子分型和聚类分析验证其稳定性和分型效果。结果显示应用建立的ERIC-PCR反应体系对50株分离株扩增均得到了9-17条、大小在200-4000 bp之间的条带,并可将其分为47个型,且分辨力达到0.996,具有较高稳定性和分辨能力。表明ERIC-PCR技术对B.cereus分型,具有简便和分辨力高等优点,可用于食源性B.cereus分离株的多样性研究。     

婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的分离鉴定及分型

采集了市场中的220份婴儿配方乳粉,利用生理生化和分子鉴定的方法对采集样品中的克罗诺杆菌进行了分离鉴定,检出10株克罗诺杆菌,污染率为4.55%。利用16S r RNA和omp A基因对克罗诺杆菌进行分型分析,都将10株克罗诺杆菌分为了2个簇,但是不同分型方法各个簇中的菌株不同。结果表明16S r RNA和omp A基因可以用于克罗诺杆菌的分型,但是辨识度不高。     

成人粪便中长双歧杆菌长亚种的分离鉴定及多位点序列分型分析

为了对成人粪便中分离的长双歧杆菌长亚种进行多位点序列分型分析,采用改良MRS培养基从健康成人粪便中分离的长双歧杆菌长亚种,通过生理生化试验结合16S rDNA和热应激蛋白60(heat-shock protein,hsp60)同源性分析鉴定分离株,利用同源性分析及多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术进一步分析长双歧杆菌长亚种的基因多态性。从12个健康成人体内分离得到24株厌氧的细菌菌株,经形态学观察、生理生化试验、16S rDNA及hsp60同源性分析发现,其中14株分离株为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp. longum)。MLST结果表明:14株长双歧杆菌长亚种可分为10种基因型,且均与Bifidobacterium longum subsp. longum ATCC 15707为不同基因型。健康成人粪便中分离的长双歧杆菌长亚种具有较大的基因多态性。     

婴幼儿辅食中细菌总数及蜡样芽孢杆菌污染情况分析

通过平板菌落计算法和最大近似值（MPN）法检测市售婴儿辅食中细菌总数和蜡样芽孢杆菌污染情况,并对MPN法得到的疑似蜡样芽胞杆菌进行基因间隔序列（ITS）插入性序列分析和形态鉴定。结果表明,101份样品中只有30份样品菌落总数达标,合格率仅为29.7%,部分超标产品的细菌总数达105CFU/g~106CFU/g。市售3种婴幼儿辅食-米粉、奶伴侣和面条中细菌总数及食源性致病菌蜡样芽孢杆菌检出情况不容乐观。     

婴幼儿配方乳粉的生产质量回顾性分析

目的 对婴幼儿配方乳粉进行回顾性分析, 以评价一定周期内产品的生产和质量稳定性。方法 选择9款婴幼儿配方乳粉产品, 随机抽取一定批次量(n范围: 25~49)的产品, 对3年周期内产品的生产工艺、生产环境、检验和产品数据进行回顾性分析。结果 生产期间环境平均温度在19.2~22.3 ℃, 平均相对湿度在48.9%~55.6%, 产品得率在99.19%~100.03%, 耗损在-0.03%~0.81%。产品中能量的相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)在0.43%~0.73%, 宏量营养素RSD在1.10%~4.81%, 总脂肪酸和必须脂肪酸的RSD在2.57%~8.76%, 矿物质类指标比维生素类指标具有范围更窄的RSD。而且, 绝大部分指标检测能力的验证结果满意, 约占总数量的91.21%; 个别指标检测能力验证结果为可疑和不满意, 分别约占总数量的4.95%和3.85%。结论 3年来婴幼儿配方乳粉产品生产质量稳定性好。     

我国婴儿配方粉来源的克罗诺杆菌脉冲场凝胶电泳分子分型和多位点序列分型研究

目的探讨我国婴儿配方粉污染克罗诺杆菌的主要分子分型特征,分析不同地区间菌株亲缘相关性,为我国克罗诺杆菌引起的疾病溯源提供技术支撑。方法采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)两种方法,对全国19个省/自治区/直辖市婴儿配方粉来源的49株克罗诺杆菌进行分型研究。结果 49株克罗诺杆菌PFGE分型得到38个带型,未发现有明显的优势分型和聚集现象。MLST共获得15个已知序列型(ST型)和2个新ST型,ST4、ST1和ST64为优势型别,分别占菌株总数的20.4%(10/49)、18.4%(9/49)、10.2%(5/49)。PFGE型和MLST型结果分析表明,具有相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型,而相同MLST型却不一定具有较高的亲缘关系。结论我国婴儿配方粉来源的克罗诺杆菌图谱具有高多态性和离散性,据此预测我国婴儿配方粉污染克罗诺杆菌导致婴儿患病以散发为主,出现多人患病的暴发事件几率较低。     

婴幼儿配方乳粉菌落总数检测与细菌污染种属分析

目的考察婴幼儿配方乳粉的微生物污染情况,分析婴幼儿配方乳粉的菌相构成。方法采用国标方法测定30批次1段、2段、3段婴幼儿配方乳粉菌落总数,使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对检出的优势菌落进行鉴定。结果 30批次婴幼儿配方乳粉的菌落总数均符合国家限量要求,其中1段乳粉菌落总数显著性低于2段和3段乳粉(P0.05)。婴幼儿配方乳粉中检出的细菌主要为芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、球形芽孢杆菌属、肠球菌属、葡萄球菌属和链球菌属,其中芽孢杆菌属检出率最高。此外, 9批次样品中检出蜡样芽胞杆菌。结论我国婴幼儿配方乳粉质量仍存在一定的风险,监管部门应加强日常监管工作。     

禽肉空肠弯曲杆菌的多位点序列分型技术研究

目的:了解禽肉空肠弯曲杆菌的耐药表型和基因型.方法:采用琼脂平板稀释法测定从零售禽肉分离的120株空肠弯曲杆菌对环丙沙星(CIP)、强力霉素(DOX)、红霉素(ERY)和硫酸庆大霉素(GEN)的敏感性.采用多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)技术,选择空肠弯曲杆菌的7个管家基因aspA、glnA、gltA、glyA、tkt、pgm和uncA作为目标基因,对这些基因分别进行PCR扩增及产物测序,并将120株菌的测序结果提交到http://pubmlst.org/campylobacter/进行分析.结果:有15株菌(占12.5%)对环丙沙星药物不敏感,19株菌(占15.8%)对强力霉素药物不敏感,4株菌(占3.3%)对环丙沙星和强力霉素都不敏感的菌株,所有菌株对红霉素和硫酸庆大霉素敏感.通过MLST得到68个(含10个新的)等位基因(alleles);43个(舍14个新的)序列型(Sequence type,ST),其主要流行序列型依次是ST-353(占15.8%)和ST-50(占7.5%);10个序列型克隆系(ST clonal complexes)和9个没有序列型克隆系,其主要流行序列型克隆系依次是ST-353克隆系(占45%)、ST-48克隆系(占13.3%)、ST-21克隆系(占10.8%)、ST-45克隆系(占5.8%)和ST-460克隆系(占5%);对环丙沙星药物和强力霉素不敏感的序列型和序列型克隆系分别是ST-353和ST-353克隆系.结论:出现对环丙沙星和强力霉素的耐药菌株.禽肉中空肠弯曲杆菌主要流行的序列型克隆系依次是ST-353克隆系、ST-48克隆系、ST-21克隆系、ST-45克隆系和ST-46 0克隆系,耐环丙沙星和强力霉素的序列型和序列型克隆系主要是ST-353及ST-353克隆系.说明应加强禽肉空肠弯曲杆菌的耐药监测.     

采用三硝基苯磺酸法测定乳基婴幼儿配方奶粉中的有效赖氨酸

采用三硝基苯磺酸法建立了乳基婴幼儿配方奶粉中有效赖氨酸的测定方法,研究了乙醚用量、水解时间以及三硝基苯磺酸的孵化时间对水解液吸光度的影响。方法线性范围为0.02～0.12 mg/mL,相关系数r2=0.999 3,检出限为3.72μg/mL,定量限为10.23μg/mL,样品重复性相对标准偏差RSD为1.55%～5.57%,回收率为86%～115%。     

婴儿粪便长双歧杆菌的分离与多样性分析

本研究旨在分析婴儿粪便长双歧杆菌的多样性,采用改良MRS培养基从哈尔滨地区健康婴儿粪便中分离双歧杆菌,采用生理生化实验结合16S rDNA和热应激蛋白60基因(heat-shock protein 60,hsp60)同源性分析鉴定分离株,利用同源性分析及随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA,RAPD)、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术进一步分析长双歧杆菌多态性。实验从11个婴儿体内分离得到18株厌氧的细菌菌株,经形态学分析、生理生化实验、16S rDNA测序及hsp60测序实验发现,其中7株为长双歧杆菌长亚种,3株为长双歧杆菌婴儿亚种。RAPD和MLST结果表明:7株长双歧杆菌长亚种为6个基因型,3株长双歧杆菌婴儿亚种为2个基因型,上述结果说明不同人源婴儿粪便长双歧杆菌基因型差异较大。     

离线SPE-LVI-GC-FID法分析婴儿配方奶粉中的饱和烃类矿物油

建立婴儿配方奶粉中饱和烃类矿物油(mineral oil saturated hydrocarbons,MOSH)的离线固相萃取(solid phase extraction,SPE)结合大体积进样-气相色谱-氢火焰离子化检测器(large volume injection-gas chromatographyflame ionization detection,LVI-GC-FID)的分析方法。该方法以正己烷为提取溶剂,提取液经硝酸银渍硅胶SPE柱净化;通过比较不同长径比SPE柱的净化效果,确定以5 mL玻璃注射器作为分离MOSH的SPE柱,收集洗脱液5 mL,浓缩后注入LVI-GC-FID测定。GC的进样口升温程序为:初始温度45℃,保持1 min(分流比200∶1),以250℃/min升温至360℃(分流阀关闭2 min),并保持27 min(分流比为100∶1);柱温箱升温程序为:35℃保持3 min,以25℃/min升温至350℃,再以5℃/min升温至370℃,保持10 min;FID温度380℃;进样量40μL。结果表明:MOSH的标准品液体石蜡在2~500 mg/kg范围内呈良好线性关系,相关系数为0.999,方法的定量限为0.05 mg/kg,加标回收率在92.62%~102.86%之间,相对标准偏差在0.85%~2.57%之间,适用于婴儿配方奶粉中MOSH的定量分析。应用该方法检测市售10种婴儿配方奶粉中的MOSH含量,其结果在0.24~1.30 mg/kg之间,其中MOSH(C16~C35)含量在0.12~0.85 mg/kg之间,表明有必要对婴儿配方奶粉中的矿物油污染进行监管。