Taqman荧光实时PCR快速检测原料乳中EPEC

建立可对原料乳中肠致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)进行快速检测的Taqman光实时PCR方法.以eae致病基因为靶基因,用特异性引物和Taqman探针进行实时PCR扩增,研究反应的特异性和检测限,并用所建立的方法对16份市售原料乳进行EPEC检测.结果表明,所用引物和探针可高效扩增出目的片段,与原料乳中其他常见致病菌无交叉反应,经2 h增菌后检测限为8.8 mL-1.对16份市售原料乳样品,检出2份含有EPEC,血清型分别为O111:K58(B4)和O127a:K63(B18).全部检测过程只需5h,可用于原料乳中EPEC的快速检测和污染调查.     

5种致泻大肠埃希氏菌实时荧光定量PCR快速检测技术

将5种致泻大肠埃希氏菌的毒力基因保守序列进行设计并合成了引物和探针,建立的多重实时荧光PCR4种试剂盒可以同时检测5种致泻大肠埃希氏菌。结果表明:4种试剂盒的12对毒力基因通过5种致泻大肠埃希氏菌的标准储备菌株均得到验证;并且12对毒力基因只对对应的致泻大肠埃希氏菌特异性起作用,对常见的食源性致病菌都无扩增曲线;escV、bfpB、stx1、ipaH和invE基因的检出限是10CFU/mL,aggR基因的检出限是10~2 CFU/mL,astA和pic基因的检出限是10~3 CFU/mL,而stx_2A、ipaH和stIb基因菌液浓度10CFU/mL时,均可观察到明显的"S"型扩增曲线,且线形较好;并且对抽查和委托检验的肉类、奶和动物腹泻物以及人工污染样品等40份样品进行检测,共检出11份阳性样本,与GB 4789.6—2016标准检测结果相一致,表明建立的4种试剂盒方法具有良好的实用性。     

采用实时荧光定量PCR法同时定性定量检测发酵乳中多种益生菌

为快速、准确地对益生菌发酵乳中的干酪乳杆菌及罗伊氏乳杆菌进行定性、定量检测,通过设计干酪乳杆菌及罗伊氏乳杆菌种属特异性引物,建立了双重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。结果表明,所建标准曲线方程线性关系良好,相关系数R²均达到0.99以上。对市售产品随机抽样检测发现:样品1、样品2未添加干酪乳杆菌及罗伊氏乳杆菌。样品3中检出干酪乳杆菌(1.39±0.25)×10⁹copies/mL,未检出罗伊氏乳杆菌。自制益生菌发酵乳检出干酪乳杆菌(3.7±0.35)×10⁹copies/mL、罗伊氏乳杆菌(4.8±0.26)×10⁹copies/mL,检测结果均与所知的益生菌种类及数量信息相符。结果表明,上述建立的实时荧光定量PCR方法能够同时对益生菌发酵乳中的干酪乳杆菌及罗伊氏乳杆菌进行快速、准确地定性、定量检测,克服了平板培养法和流式细胞术的局限,具有一定的优势和应用前景。     

实时荧光定量PCR法快速检测食品中大肠埃希菌

目的应用实时荧光定量PCR技术,结合3~5 h的前增菌处理,建立食品中大肠埃希菌的快速、灵敏、定量的检测方法。方法以大肠埃希菌(ATCC 25922)为参考菌株,对培养基和培养温度进行优化,选择最佳的前增菌培养条件。将不同浓度的参考菌株和样品分别接种前增菌液中培养3~5 h。采用Triton-X 100提取增菌后的DNA,实时荧光定量PCR扩增大肠埃希菌特异性片段。所得Ct与对应的原始(增菌前)参考菌株的浓度,建立标准曲线,计算样品中大肠埃希菌的数量。结果纯培养模式下,经过3、4和5 h的前增菌后,标准曲线具有很好的线性,r2分别为0.996、0.992和0.991,对应的检测限为136、14和1.4 cfu/100 ml;含杂菌培养模式下,NB和EC肉汤42.0℃增菌4 h后,建立的标准曲线r2分别为0.972和0.978。在不同食品中该方法的加标回收率为74.0%~174.0%。结论 3~5 h的前增菌实时荧光定量PCR方法可以快速、灵敏、定量地检测食品中活的大肠埃希菌。     

两株乳酸菌发酵上清液对E.coli作用分析及培养条件优化

以植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌为研究对象,以大肠杆菌为指示菌,通过琼脂扩散法首先分析植物乳酸杆菌和保加利亚乳酸杆菌的发酵上清液对大肠杆菌的抑菌活性差异,然后再观察不同培养温度、葡萄糖浓度、pH和培养时间对植物乳杆菌发酵上清液抑菌效果的影响。结果显示,植物乳杆菌在35℃,8%葡萄糖,pH为9时,发酵上清液抑菌效果较好。经过正交优化实验得出最佳条件组合为:培养温度35℃,培养基pH7,葡萄糖浓度8%,培养时间36h,抑菌圈直径为(1.451±0.016)cm。研究还发现,保加利亚乳杆菌发酵上清液对大肠杆菌无抑制作用。      

一种快速定性和定量检测发酵乳中L.fermentum的方法

通过比对发酵乳杆菌(L.fermentum)与其他乳酸菌的16S rRNA基因序列的异同,设计出L.fermentum的种属特异性引物,应用此引物进行种属特异性PCR和实时荧光定量PCR反应,通过琼脂糖凝胶电泳图谱和实时荧光定量PCR图谱分析,建立一种快速检测发酵乳中L.fermentum定性和定量测定方法.     

基于内参的大肠埃希氏菌O157∶H7实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

针对大肠埃希氏菌O157∶H7 rfbE和Flic靶基因保守序列,设计特异性引物和探针,优化反应体系,并加入内参（internal amplification control,IAC）,建立能够实时监控反应过程的荧光定量聚合酶链式反应（polymeasechain reaction,PCR）检测方法。结果表明,该方法对E. coli O157∶H7基因组DNA的最低检测限为1 pg/μL;对含有靶基因质粒的最低检测限为103 copies/μL;对细菌的最低检测限为5×103 CFM/mL;Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系（R2=0.999）。人工污染实验结果表明,在初始菌量为7 CFM/25 g时,采用水洗加试剂盒法提取DNA,E. coli O157∶H7在增菌6 h后即可检出;而采用水煮法提取DNA,则在增菌10 h后方可检出。建立的E. coli O157∶H7实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中O157∶H7,又能实时监测PCR反应过程,有效防止“假阴性”的发生。     

应用RT-PCR技术定量检测发酵乳中Lactobacillus plantarum活菌数

根据发酵乳中常见乳酸菌种的16S rRNA基因序列设计了L.plantarum的种属特异性引物,应用该引物对植物乳杆菌的模式菌株L.plantarum ATCC14917、L.plantarum非同源性对照菌株及采自西藏地区的自然发酵乳样品进行了种属特异性PCR检测,并以样品RNA转录的cDNA为模板,对检出含有L.plantarum的发酵乳样品进行了Real-Time PCR定量检测。通过Real-Time PCR图谱分析,准确地检测出了该样品中L.plantarum活菌数的含量为6.6lgcfu/mL。结果表明该方法能够简便、快速地检测出发酵乳中是否含有L.plantarum,并能够对其活菌数进行准确地定量,对发酵乳的生产和监管提供了重要的理论和实践依据。     

传统发酵豆制品中3种致病菌的三重荧光PCR快速检测方法的建立

为了建立传统发酵豆制品中单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的三重荧光PCR快速检测方法。以单增李斯特菌hly A基因、蜡样芽孢杆菌Cereolysin AB基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因设计引物与TaqMan探针,通过优化PCR反应体系,建立了可同时检测单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的三重荧光定量PCR体系,并进行了特异性和敏感性试验。结果显示,该方法灵敏度高,特异性强,重复性好。对26株非目标菌进行检测,结果均为阴性,而定量检测批内和批间的变异系数均小于2%。单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌敏感性试验结果表明,这三种细菌的最低检测浓度分别为3×103cfu/mL、2×104cfu/mL、2×104cfu/mL。应用该方法可在8h内完成对样品中单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的同步检测。     

食品微生物检测中PCR技术的应用

食品微生物检测是检验食品中微生物的种类、数量、性质及其对人们健康的影响,以判别食品是否符合质量标准的检测方法。传统微生物检测方法（如培养法、显微镜观察法等）虽然准确性较强,但常因耗时长、操作繁琐而难以满足迅速反应的需求。本文基于PCR技术的原理与优势,选取大肠埃希氏菌检测、沙门氏菌检测、金黄色葡萄球菌检测以及非致病菌检测,分析PCR技术的实际应用流程及应用效果,以期为PCR技术的高效应用提供参考借鉴。     

以腌渍辣椒水作为发酵剂发酵干辣椒的微生物筛选

该研究选择盐渍辣椒汁配以一定比例干辣椒混合发酵,探讨盐渍辣椒汁的利用新途径。选取2株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）1.3919、1.555、2株产香鲁氏接合酵母菌（Zygosaccharomyces rouxii）2.1913、2.371和1株凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）1.3220作为原始菌株,通过对其生长曲线、产酸能力、耐盐能力的测试最终筛选出植物乳杆菌1.3919和鲁氏接合酵母菌2.371为最适发酵菌,其正常条件下最大OD850 nm值分别为5.41、5.40;而产酸能力则分别为1.98%、0.65%;上述两株菌在盐度为10%条件下有较强耐受力,其最大OD850 nm值均达到5.4。将其分别接入以盐渍辣椒汁∶干辣椒（3∶1）体系中进行发酵,各组产酸能力均在15 d时达到最大,菌株1.3919、2.371的酸度分别为1.23%、1.03%。     

来宾酒糟酸菜中降胆固醇乳酸菌的筛选鉴定及发酵工艺研究

该研究采用钙溶圈法及MRS-胆固醇培养基从来宾酒糟酸菜汁中分离筛选具有降胆固醇能力的乳酸菌,通过形态观察及分子生物学技术对其进行菌种鉴定,同时对其耐酸性、耐胆盐性能进行研究,并以胆固醇去除率为考察指标,通过单因素试验及正交试验对其发酵条件进行优化。结果表明,筛选得1株具有去除胆固醇能力的乳酸菌,编号为XL-02,经鉴定,菌株XL-02为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）,其具有较好的耐酸能力和胆盐耐受性。在pH2.0的酸性环境下培养24 h,菌株存活率为3.14%;在胆盐含量为0.3%条件下培养24 h,菌株存活率为12.17%。菌株XL-02去除胆固醇的最优发酵条件为以MRS液体培养基为发酵培养基,初始pH值6.0,接种量4%,发酵温度39 ℃,发酵时间72 h。在此优化条件下,胆固醇去除率为（61.56±0.08）%。     

叠氮溴化丙锭-qPCR法定量检测植物乳杆菌

目的：选取植物乳杆菌单拷贝基因plnF为靶基因,设计引物探针,将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时荧光聚合酶链反应(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)相结合,建立了活性植物乳杆菌定量检测PMA-qPCR方法。方法：优化PMA反应条件,进行特异性验证,建立标准曲线,验证灵敏度,并将该方法用于检测人工添加奶粉、米粉、酸奶样品以及冻干样品中的植物乳杆菌。结果：显示经PMA条件优化,最佳PMA浓度为2μg/mL,最佳曝光时间为10min,所建立的PMA-qPCR方法可以快速、高效地检测植物乳杆菌,利用细菌纯培养物与对应Ct值建立标准曲线,可以看出纯培养物浓度与Ct值之间存在对应线性关系,相关系数(r_² )为 0.9992,最低检测限为15拷贝/反应体系,人工添加样品以及冻干样品检测中PMA-qPCR和平皿计数法结果的对数值进行配对t检验,结果显示两者结果在不同的人工添加样本以及冻干样品中均无显著性差异(P＞0.05)。结论：本研究建立的PMA-qPCR检测方法能快速准确、特异、灵敏地定量检测植物乳杆菌。     

实时荧光定量PCR技术快速检测志贺氏菌

目的 建立实时荧光定量PCR法快速检测志贺氏菌。方法 提取志贺氏菌基因组为模板扩增virA基因片段, 将目的片段连接至pMD19-T载体得到重组质粒, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 验证所得到的重组质粒, 以紫外分光光度计测量重组质粒吸光度值A260, 并换算为质粒拷贝数后作梯度稀释得到不同浓度的质粒标准品; 进行荧光定量PCR分析并通过特异性、灵敏性实验以验证该方法的可行性。结果 重组质粒标准品浓度在103~108 copies/μL范围内线性关系良好(r2>0.99), 实时荧光定量PCR检测志贺氏菌时出现良好的扩增曲线, 鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均未出现扩增曲线。志贺氏菌的检出限为100 CFU/mL。 结论 本方法便捷、高效、可靠, 可用于志贺氏菌的快速定性定量检测。     

枸杞果汁发酵过程复合乳酸菌的实时定量检测

利用植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）、发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）和瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）混合菌种进行枸杞果汁发酵。该研究对乳酸菌亚致死修复液的组成和修复温度进行优化,分别针对3株乳酸菌设计特异性引物,利用叠氮溴化丙锭（PMA）-荧光定量聚合酶链式反应（fqPCR）的方法,实时荧光定量检测枸杞果汁发酵过程中乳酸菌活菌数。结果表明,优化修复液的组成为蛋白胨1 g/L、牛肉浸出粉0.3 g/L、氯化钠0.5 g/L、吐温80 0.10 g/L、丙酮酸钠0.09 g/L、过氧化氢酶0.04 g/L、MgCl2 3 mmol/L、Na2HPO4 1 mmol/L、MnCl2 2 mmol/L和FeCl2 2 mmol/L。在27 ℃条件下培养15 min,乳酸菌亚致死细胞修复率达到97%。利用该方法实现了枸杞果汁发酵过程不同乳酸菌的实时定量检测,为今后枸杞果汁发酵生产过程中的微生物动态监测提供了方法。     

温度对甘蓝泡菜发酵过程中风味的影响

为研究温度对甘蓝泡菜发酵过程中风味的影响,采用高效液相色谱法和顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用法分析10、15、25、35℃发酵泡菜液的有机酸、氨基酸和挥发性成分,结合主成分分析确定泡菜液重要挥发性成分.结果表明,在10～35℃,提高温度有利于泡菜快速产酸,缩短成熟期.温度与乳酸和乙酸呈正相关,与柠檬酸、苹果酸和游离氨...     

Assessment of Fusarium infection in wheat heads using a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) assay

The accuracy of a quantitative polymerase chain reaction assay in quantifying the DNA of trichothecene-producing F. culmorum and F. graminearum within harvested wheat grains and head tissue was evaluated in comparison with incidences of infected kernels and deoxynivalenol levels. In a first experiment, six durum and bread wheat varieties were grown in randomized plots for a 2-year period, and inoculated with Fusarium macroconidia at six growth stages between heading and dough ripening, to obtain a wide range of Fusarium head blight incidences. There was a close relationship between fungal DNA and the amount of deoxynivalenol, and this relationship was consistent over Fusarium species, wheat species and varieties, and over a wide range of Fusarium head blight infection. In a second experiment potted wheat plants were grown under environmentally controlled conditions and inoculated with the two Fusarium species at full flowering; head samples were collected before inoculation and after 6 h to 12 days, and processed by the quantitative polymerase chain reaction assay. This assay made it possible to detect the dynamic of fungal invasion in planta after infection had occurred, and to single out the presence of infection before the onset of the disease symptoms: A robust detection of the infection occurred within 18-24 h for F. culmorum, and within 2-9 days for F. graminearum.     

The development of lactic acid bacteria and Lactobacillus buchneri and their effects on the fermentation of alfalfa silage

This study was conducted to document the development of populations of lactic acid bacteria (LAB) and Lactobacillus buchneri in alfalfa silage treated with various inoculants. Wilted and chopped alfalfa (45% dry matter) was treated with 1) distilled water (untreated, U), 2) Lactobacillus buchneri 40788 (4 × 10⁵ cfu/g; LB), or 3) L. buchneri 40788 (4 × 10⁵ cfu/g) and Pediococcus pentosaceus (1 × 10⁵ cfu/g; LBPP). Forages were packed into triplicate vacuum-sealed, nylon-polyethylene bags per treatment, and ensiled for 2, 5, 45, 90, and 180 d. Viable (cfu) LAB in forage and silage were quantified by traditional plating on selective agar, and numbers of L. buchneri (cfu-equivalent, cfu-E) were quantified by real-time quantitative PCR. Fresh, untreated forage had 5.52 log cfu of LAB/g and 3.79 log cfu-E of L. buchneri/g. After 2 d of ensiling, numbers of LAB increased to >8 log cfu/g in all silages. In contrast, numbers of L. buchneri in U remained below 4 log cfu-E/g but reached approximately 7 log cfu-E/g in LB and LBPP. From d 5 onward, numbers of L. buchneri in U remained below 6 log cfu-E/g but approached 9 log cfu-E/g in LB and LBPP. The pH was lower in LBPP compared with U and LB after 2 and 5 d of ensiling, but pH was lower for U compared with LB and LBPP thereafter. Treatments LB and LBPP had more acetic acid than U at 45 d of ensiling, which coincided with detectable amounts of 1,2 propanediol. Inoculation with LBPP resulted in silage with the highest concentration of 1,2 propanediol after 180 d of ensiling. From d 45 onward, LB and LBPP silages had lower concentrations of residual water-soluble carbohydrates but had higher concentrations of ammonia-N than U. In conclusion, epiphytic L. buchneri can be detected in alfalfa but this population is unable to lead the silage fermentation. In contrast, when L. buchneri was added to silage as an inoculant, the numbers of L. buchneri (cfu-E) increased markedly but did not dictate fermentation until 45 d of ensiling. These findings help to explain why the response (in increased acetic acid) from the addition of L. buchneri in silages is not immediate.     

多重实时荧光定量PCR快速检测婴幼儿奶粉中沙门氏菌、克罗诺杆菌和金黄色葡萄球菌

目的建立多重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR,multiplex qPCR)快速检测奶粉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和克罗诺杆菌3种常见致病菌的方法。方法筛选目标菌株的特异性引物与探针,优化反应体系,建立稳定的多重q PCR反应体系。通过阳性菌株加标的方式验证体系的特异性,并确定人工污染奶粉的检出限。结果各对引物探针对目标菌株均能扩增,多重实时荧光PCR未发现交叉反应,对17株非目标菌进行检测均未检出,人工污染奶粉中克罗诺杆菌和沙门氏菌的检出限均为10~3 CFU/mL,金黄色葡萄球菌的检出限为10~4 CFU/mL。结论本研究方法可实现婴幼儿奶粉样品中3种致病菌qPCR高效率检测。