食源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜的形成及相关基因的检测

为了解食源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S. aureus,MRSA）生物被膜形成能力及其相关基因携带情况。采用刚果红琼脂法和96孔板法测定22株食源性MRSA菌株（包括：原料乳分离株4株,鸡肉、速冻水饺和即食食品分离株各6株）的生物被膜形成能力,同时通过PCR方法对MRSA菌株生物被膜形成相关的15个基因进行检测分析。22株MRSA菌株中,刚果红琼脂法和96孔板法分别检测出21株（95.45%）和22株（100.00%）有生物被膜形成能力。96孔板法测定菌株生物被膜形成能力弱、中等和强的检出率分别为54.55%、40.91%和4.55%。MRSA菌株生物被膜相关基因clfA、fib和eno的携带率最高均为95.45%,其次是clfB（90.91%）、fnbB（54.55%）、icaBC和ebpS（都为45.45%）、agr（27.27%）、icaAD和cna（都为22.73%）、fnbA（13.64%）,sar,bbp和sigB（都为4.55%）。此外,来自原料乳和即食食品的MRSA菌株较生鸡肉和速冻水饺MRSA菌株生物被膜形成能力强（p<0.05）。结果表明,96孔板法能够进行定性和定量检测生物膜的形成,而刚果红琼脂法只能定性检测生物被膜的形成,两者的定性检测结果存在一定的差异。通过96孔板法定量检测的结果表明食源性MRSA菌株普遍能形成生物被膜,其中存在一些生物被膜形成能力强的MRSA菌株,同时大部分MRSA菌株不依赖ica途径形成生物被膜,提示产肠毒素MRSA菌株形成生物被膜定植在食品加工过程的环境中,不易清除,成为食品安全中的潜在隐患。     

传统发酵食品中分离的乳酸菌粗提物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑菌机制研究

目的 探究乳酸菌HS011(LactobacillusplantarumMG5276)、德氏乳杆菌保加利亚亚种HS023(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus strain NDO4)、嗜热链球菌HS033 (Streptococcus thermophilus 3233)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的抑菌机制。方法 以MRSA为研究对象,探索乳酸菌粗提物对MRSA菌株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)的影响、抗菌药物复合作用对细菌生长的影响、抽提物对MRSA生物被膜抑制和清除效果,以及抽提物对MRSA细胞膜完整性的破坏作用等。结果 乳酸菌粗提物HS011、HS023、HS033对MRSA的MIC分别为5.75、5.00、6.00mg/mL;指示菌MRSA的生长过程受到粗提物明显抑制,在6h时HS011、HS023、HS033对MRSA的抑菌率分别为28.69%、69.20%和42...     

抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株的筛选与鉴定

通过对246株芽孢杆菌进行筛选,以期获得对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）具抑制作用的菌株,抑菌结果表明,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有抑制作用的菌株有5株,其中菌株1012-4的抑菌活性最强;为确定菌株种属,对优选菌株进行形态特征观察、生理生化特征鉴定以及API50 CHB鉴定,初步确定1012-4为枯草芽孢杆菌;为进一步确证菌株类型,实验采用了16S rDNA基因测序,序列结果表明,菌株1012-4为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌种;经反复确证,确定菌株1012-4为优势菌株,抗菌活性显著,为新型抗MRSA药物的研发提供了菌株来源。     

抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株的筛选、鉴定及其活性物质初步研究

从海南红树林土壤分离筛选抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株,通过形态学观察、生理生化试验及分子生物学进行菌种鉴定。采用不同培养基优选抑菌活性物质生成条件;以有机溶剂萃取抑菌活性物质,采用气相色谱-质谱（GC-MS）分析抑菌物质化学成分,采用微量稀释法测定最低抑菌浓度与最低杀菌浓度。结果表明,筛选得到一株抗MRSA菌株,编号为NEL-002,被鉴定为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。菌株NEL-002采用LB液体培养基得到发酵液经石油醚萃取粗提物抗MRSA菌活性最强,且在40～80 ℃、pH在5～10较稳定,对多种蛋白酶不敏感;最低抑菌质量浓度为62.5 μg/mL,最低杀菌质量浓度为500 μg/mL。GC-MS鉴定出抗菌活性物质为十甲基环戊硅氧烷、十二甲基环六硅氧烷及邻苯二甲酸二丁酯。     

食品接触表面对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响

在食品工业中,如果金黄色葡萄球菌粘附在食品接触表面并形成生物被膜,不但会造成设备的腐蚀,更重要的是会污染食品,影响了食品的安全性.生物被膜形成的第一步是微生物在食品接触表面的粘附.本文研究了4种不同食品接触表面对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响.结果表明：与玻璃和PE塑料相比,不锈钢表面粘附形成生物被膜的活菌数较多.不同的食品接触表面影响了生物被膜的形成.     

黑龙江耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药及分子分型研究

目的了解黑龙江省健康人与屠宰场猪耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)携带情况,及其耐药和分子分型情况。方法参照黑龙江省金黄色葡萄球菌专项监测方案,对分离的金黄色葡萄球菌进行药物敏感性检测筛选MRSA,对MRSA进行spa、MLST和SCCmec基因分型,同时检测pvl基因。结果 1500份健康人样本分离出257株金黄色葡萄球菌(17.13%, 257/1500), 500份猪样本分离出149株金黄色葡萄球菌(29.8%, 149/500)。所有菌株对万古霉素、替考拉宁和利奈唑烷均敏感,对红霉素和克林霉素耐药率较高。MLST分型结果为ST9型, 1株未鉴定出型别。spa分型为t899和t2922, t899为主要型别(83%, 29/35)。SCCmec分型结果为IVb型, pvl基因均为阴性。结论黑龙江省健康人MRSA携带率比例较低,屠宰场猪携带一定程度MRSA,且猪源金黄色葡萄球菌耐药情况较重,应控制养殖动物抗生素的使用。     

我国市售食品中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌污染情况研究进展

摘要： 近年来我国市售食品中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Meticillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）的检出愈发常见,并呈现出污染食品种类多、污染地区范围广的特点。MRSA污染的食品不仅增加了食品从业人员和消费者罹患细菌感染的风险,同时MRSA的污染也会伴随着食品的生产加工和贸易流通,逐渐打破原有的地域限制,呈现出更为复杂的污染特征。在我国,不同类型的市售食品中MRSA的污染率差异较大,主要污染型别也各不相同,这对污染的溯源调查和防控带来了巨大挑战。并且随着食品贸易和人员流动,呈现出污染食品种类多、污染地区范围广的特点。不同食品中MRSA的污染率差异较大,且主要型别复杂多样。本文对近年来我国市售食品中MRSA的污染状况进行综述,针对不同市售食品中MRSA的污染特征、主要污染来源以及食品中不同类型MRSA的致病性或耐药性特征进行分析和探讨,为后续对重要食品中MRSA的主要流行型别开展风险评估和传播机制研究、污染防控提供新的思路。     

食品添加剂对食源性金黄色葡萄球菌生物被膜的影响

从腐败食品分离筛选金黄色葡萄球菌,研究食品添加剂对金黄色葡萄球菌生物被膜的影响。按国标方法鉴定金黄色葡萄球菌。在不同质量浓度的防腐剂和乳化剂作用的情况下,用96孔板法检测金黄色葡萄球菌生物被膜形成情况。结果表明:在添加低质量浓度防腐剂山梨酸钾和苯甲酸钠后,金黄色葡萄球菌成膜能力受抑制,当两者质量浓度均≥0.4g/L时无成膜作用,且山梨酸钾抑制成膜趋势比苯甲酸钠明显;添加单甘酯后,质量浓度3g/L成膜率最低,而双甘酯质量浓度4g/L成膜率最低,两者比较,在质量浓度2～4g/L范围内单甘酯抑制成膜比双甘酯好;对于蔗糖酯类乳化剂,在质量浓度0.3～4g/L范围SE7和SE13都显现抑制成膜作用,而SE11整体出现成膜率下降趋势;非离子型表面活性剂吐温-80、Span-60对金黄色葡萄球菌成膜影响不同,与两者自身亲水亲油性相关。因此,这几类食品添加剂对金黄色葡萄球菌生物被膜具有一定抑制作用。     

低浓度乙二胺四乙酸对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响

研究了低浓度乙二胺四乙酸(EDTA)对食源性病原菌金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响。实验结果表明,0.2mmol/L的EDTA可有效抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成;EDTA只能影响金黄色葡萄球菌生物被膜形成的早期阶段;Ba2+不能完全阻断EDTA抑制生物被膜生成,Fe2+、Ca2+、Mg2+可以阻断EDTA抑制生物被膜的效应;即使是高浓度的EDTA也不能影响成熟的细胞被膜数量;EDTA能抑制细胞之间的粘附作用。     

食品中金黄色葡萄球菌生物被膜形成基因分析及影响因素研究

分析金黄色葡萄球菌食品分离菌株生物被膜形成相关基因,研究茶多酚和乳酸链球菌素(Nisin)对不同菌株生长及生物被膜形成的影响。以实验室保存的16株金黄色葡萄球菌食品分离菌株为研究对象,采用聚合酶链式反应(PCR)检测14种生物被膜形成相关基因;通过微孔板法研究不同浓度茶多酚和Nisin对不同菌株生长的抑制作用,确定最小抑菌浓度(MIC);在此基础上进一步研究茶多酚和Nisin对生物被膜形成能力影响。结果表明:14种生物被膜形成相关基因中有10种被检出,其中cna、ebp S、fib和ica AD基因检出率为100%,sas C为87.5%、fnb A为68.75%、sas G为68.75%、clf B为68.75%、eno为62.5%,ica BC为56.25%;16株菌株中均不携带bbp、bap、clf A和fnb B基因。16株菌株均能形成生物被膜,但形成能力有差异,其中F23、F44、F58、F64、F71、F86、F107和F109等8株菌株为被膜强形成菌株,F7、F19、F40、F46、F60、F99、F101、F106等8株菌株为被膜弱形成菌株。茶多酚和Nisin对16株金黄色葡萄球菌食品分离菌株的MIC范围分别为0.1~0.2 g/L和0.125~1 g/L,茶多酚和Nisin在1/2MIC和1/4MIC浓度下对生物被膜形成抑制作用明显(p<0.05),且茶多酚抑制效果强于Nisin。本研究结果为食品中金黄色葡萄球菌生物被膜形成控制具有参考意义。      

冷诱导金黄色葡萄球菌环境胁迫耐受性及生物被膜控制

为研究金黄色葡萄球菌经冷诱导后对其他环境胁迫耐受性的变化,将耐冷冻能力较强的分离株S.aureus W3与标准菌株S.aureus CICC10201分别在4 ℃下冷胁迫5 h后,测定其在高温、酸碱、氯化钠、过氧化氢、酒精的胁迫下存活率变化。同时对分离株S.aureus W3的生物被膜形成及控制进行了研究。结果表明,经-20 ℃冷藏8周后,S.aureus W3的存活率显著高于S.aureus CICC10201(p<0.05)。经冷诱导后,S.aureus W3在45~60 ℃环境下存活率提升至18.5%。冷诱导使金黄色葡萄球菌对酸敏感性增强但对碱产生交叉抗性。冷诱导后的两株菌在氯化钠中的存活率均降低,S.aureus W3最低下降了24.09%。另外,冷诱导后金黄色葡萄球菌对酒精的耐受性增强。分离株S.aureus W3在冷诱导前后过氧化氢耐受性没有明显变化(p>0.05),但标准菌株S.aureus CICC10201敏感性增强,存活率显著下降(p<0.05)。分离株S.aureus W3较S.aureus CICC10201具有更强的生物被膜形成能力,运用1% 84消毒水能有效清除其生物被膜。本研究为冷冻食品中金黄色葡萄球菌的安全控制提供理论依据。     

合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性及稳定性研究

目的:研究合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性及稳定性。方法:采用牛津杯法及96孔法测定合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及最小抑菌浓度,并探讨温度、反复冻融、酸碱、紫外线、金属离子、胰蛋白酶和胃蛋白酶对合浦珍珠提取物抑菌活性的影响。结果:合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌活性,最小抑菌浓度为0.94 mg·mL^-1,且抑菌活性呈一定的剂量依赖效应。以8×MIC合浦珍珠提取物进行抑菌稳定性实验,以金黄色葡萄球菌的OD₆₀₀值为指标进行探讨,结果显示,合浦珍珠提取物在pH3.0~9.0抑菌活性保持稳定,但在pH11.0相比pH7.0抑菌活性,保留约70%;在-80~80 ℃抑菌活性保持稳定,但在100 ℃相比4 ℃处理30 min抑菌活性保留约68%;在-20 ℃反复冻融及20 W紫外灯照射条件下,提取物抑菌活性保持良好的稳定性;在25~200 mmol·L^-1的NaCl、KCl、CaCl₂条件下,提取物抑菌活性稳定,但在25~200 mmol·L^-1MgCl₂条件下,抑菌活性逐渐降低,在200 mmol·L^-1 MgCl₂时,抑菌活性相比未添加金属离子组保留约40%;提取物对胰蛋白酶处理保持良好的抑菌稳定性,但在胃蛋白酶处理下,抑菌活性消失,说明对胃蛋白酶敏感。结论:合浦珍珠提取物对金黄色葡萄球菌具有稳定的体外抑制活性,为其今后在食品工业上的应用和开发提供一定的理论基础。     

Staphylococcus aureus and Escherichia coli in nham (Thai-style fermented pork sausage)

The fate of Staphylococcus aureus and Escherichia coli was determined when they were introduced into ground pork made into nham (Thai-style fermented pork sausage) with or without 0.75 or 1.5% added starter culture. Without starter culture, the numbers of E. coli remained little changed but there was slow multiplication of S. aureus. With 0.75% starter culture, S. aureus was no longer detectable after 48 h and E. coli numbers decreased by 1 log after 96 h. No viable S. aureus or E. coli were recovered after 36 h and 96 h, respectively, when 1.5% starter culture was added. The addition of a starter culture is recommended when making nham.     

山苍子精油对MRSA生物被膜及其调控基因ica A的抑制机理研究

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是一种常见的人畜共患病原菌,极易在食品加工设备表面生成生物膜,增加食物污染的风险。山苍子精油作为植物源天然提取物,对S.aureus有良好的抗菌效果,但其抗MRSA生物膜能力及作用机制还知之甚少。本实验研究了山苍子精油对MRSA生物被膜及其多糖细胞间黏附素(PIA)的调控基ica A的抗菌机制。结果表明:山苍子精油对MRSA生物膜的MBIC是2.0mg/mL,MBEC是4.0mg/mL;由菌落计数法可知,山苍子精油的抗MRSA生物膜能力与精油浓度和处理时间呈正相关。抗生物膜机制的初步探索结果表明,MRSA生物膜的代谢水平和细胞外聚合物(胞外多糖,胞外蛋白和胞外DNA)的形成受到山苍子精油的抑制。此外,在分子水平上的实验结果表明,山苍子精油可以显著抑制MRSA生物膜中ica A基因的转录水平。     

工业大麻叶对金黄色葡萄球菌的抑菌机制

探索工业大麻叶的抑菌组成及对金黄色葡萄球菌的抑菌机制,为以工业大麻叶成分为先导化合物开发新型天然防腐剂提供理论依据。工业大麻叶乙醇提取物经乙酸乙酯萃取、硅胶柱分离,采用微量二倍稀释法确定最低抑菌浓度(MIC),获得高活性组分,GC-MS分析抑菌组成;研究作用前后菌体细胞壁完整性、细胞膜通透性、能量代谢和氧化损伤变化,探讨抑菌机制。结果表明,工业大麻叶Fr5(石油醚和乙酸乙酯的体积比为1∶1)组分抑菌效果最佳,对金黄色葡萄球菌的MIC为31.25μg/mL,GC-MS共鉴定出24种化合物;经Fr5处理后,细菌表面明显凹陷,胞外碱性磷酸酶(AKP)活力升高,培养液电导率升高,核酸相对浓度增加,可溶性蛋白质质量浓度增大,菌体三磷酸腺苷(ATP)浓度和超氧化物歧化酶(SOD)活性均先升后降。工业大麻叶Fr5可破坏金黄色葡萄球菌细胞壁和细胞膜结构,导致细胞膜通透性增加,内容物外泄,进而影响菌体能量代谢并造成质膜氧化损伤,最终抑制细胞生长。     

柠檬烯对铜绿假单胞菌的抑菌活性及其机理

以铜绿假单胞菌为供试菌,研究了柠檬烯对铜绿假单胞菌的抑菌活性及机理。利用肉汤稀释法测定了最小抑菌浓度(MIC),评价了柠檬烯抑菌活性,通过细菌生长曲线的测定、扫描电镜观察、细胞膜通透性以及膜电位的测定,诠释柠檬烯对铜绿假单胞菌的抑菌机理。结果表明:柠檬烯能抑制铜绿假单胞菌的正常生长和增殖,最小抑菌浓度为10 mL/L;柠檬烯可以破坏细胞的正常形态,提高菌液的相对电导率,增加细胞膜的通透性;柠檬烯也能降低铜绿假单胞菌菌体的膜电位,干扰细胞正常代谢活动。柠檬烯通过破坏细菌细胞膜的方式,抑制铜绿假单胞菌生长,导致细菌细胞死亡。这说明柠檬烯可以改变铜绿假单胞菌细胞膜的通透性,破坏其正常细胞形态结构及完整性,从而有效地抑制铜绿假单胞菌的正常生长。     

The influence of manufacturing and drying conditions on the survival and toxinogenesis of Staphylococcus aureus in two Spanish dry sausages (chorizo and salchichón)

The effects of formulation, starter culture and fermentation temperature on growth and synthesis of toxin A (SEA) and TNase by Staphylococcus aureus during fermentation and drying of Spanish chorizo were investigated. Inhibitory factors able to inhibit SEA synthesis in culture media were unable to prevent SEA production in chorizo fermented at 20 and 30°C, though a lower temperature and starter culture SP318 (Lactobacillus sake, Pediococcus pentosaceous and Staphylococcus xylosus) decreased staphylococcal growth and SEA formation. Reduction and even disappearance of the SEA during ripening was observed. In most batches, TNase was a reliable indicator of staphylococcal growth and SEA production. Dextrose added to the salchichón formulation repressed S. aureus growth during drying. Lactobacillus curvatus in combination with dextrose was an effective anti-staphylococcal agent during fermentation.     

HS-SPME-GC/MS-AMDIS用于金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物指纹图谱的初步研究

根据金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的轮廓特征,建立金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物指纹图谱。在7.5% NaCl肉汤培养基中,采用顶空固相微萃取/气相色谱质谱联用技术(HS-SPME-GC/MS)及自动质谱光谱反卷积与识别系统(AMDIS),结合《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》检测分析金黄色葡萄球菌的挥发性代谢产物。研究确立了由17个金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物目标化合物组成的质谱数据库,并在此数据库的基础上分析得到10组图谱的相似度均在0.90以上,符合指纹图谱的技术要求,基于此建立了金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物指纹图谱。采用HS-SPME-GC/MS-AMDIS方法鉴定的物质在NIST检索时正向和反向匹配度均大于800,在AMDIS目标化合物质谱数据库中最小匹配度均大于80,结果准确、可靠、操作简单。建立的金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物指纹图谱可作为金黄色葡萄球菌质量监测及分析方法的参考。     

亚硝酸钠对金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜形成的抑制作用

本文以金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为研究对象,采用微孔板检测法,分别以OD630值与生物被膜清除率反映两种菌的生物被膜生成量及不同培养时间添加不同浓度亚硝酸钠对两种菌形成生物被膜的抑制效果,并通过细胞表面反应和细胞间聚集实验初步研究其抑制机理。结果表明:亚硝酸钠对两种致病菌生物被膜的形成均有一定的抑制作用,600 mg/L、培养48 h对金黄色葡萄球菌生物被膜清除率达37.31%,抑制效果最佳;而对副溶血性弧菌而言,添加200 mg/L亚硝酸钠培养12 h时清除率达36.67%,效果最佳。由细胞表面反应与细胞间聚集实验结果表明,亚硝酸钠能有效抑制两种菌的表面粘附和菌体聚集,其主要通过影响细胞聚合与表面粘附,从而抑制金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜的形成与生长。