马铃薯Y病毒两个黑龙江烟草分离物的全基因组序列分析

为明确黑龙江烟区马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)分子株系和进化特征,从哈尔滨和牡丹江感病烟草采集到Harbin和MDJ两个样品,通过RT-PCR扩增了其全基因组序列,并进行了一致率、重组、系统发育和选择压力等分析。结果表明,2个分离物(GenBank登录号分别为MH933741和MH933742)基因组全长均为9699核苷酸。Harbin与MDJ和比利时分离物GBVC 26(JQ969039)一致率最高,为98.5%;MDJ与Harbin和GBVC 26一致率最高,为98.5%。Harbin是美国分离物Oz和瑞士分离物N-605的重组体,MDJ是美国分离物CW和N-605的重组体。利用全基因组序列构建的系统进化树显示,PVY分离物分为9个组,Harbin和MDJ均属PVYN-Wi组。PVY的11个基因均处于负选择,其中NIa蛋白基因的选择压力最大。      

云南烟草中烟草花叶病毒株系比较与分析

利用TAS-ELISA方法对采自云南不同烟草种植区的710份花叶病样进行检测,其中546份样品与TMV抗体呈阳性反应。根据地理分布的差异,选择了38个代表性分离物进行TMV外壳蛋白基因的IC-RT-PCR扩增、克隆和测序。测序分析表明,38个TMV cp基因核苷酸序列相似性在95%~100%之间,其推导的氨基酸序列同源性为97.5%~100%。云南不同TMV分离物与TMV-U1、TMV-Fujian核苷酸相似性大于90%,其系统关系与TMV-U1和TMV-Fujian分离物聚为一簇,研究表明云南38个烟草分离物均属于TMV-U1株系。      

烟草脉带花叶病毒基因组序列分析

为了探明烟草脉带花叶病毒危害和流行的机制,使用RT-PCR技术扩增获得TVBMV云南分离物YN9.1基因组全序列,并进行了基因组结构、序列同源性、氨基酸保守基序、系统进化和重组分析。结果表明:(1)YN9.1基因组具有Potyvirus属病毒典型特征,含有在Potyvirus属病毒中较为少见的NIb/CP切割位点Q/N;(2)YN9.1与其它分离物核苷酸序列同源性为90.5-91.1%,氨基酸序列同源性为95.2-96.2%。与YND核苷酸和氨基酸序列同源性最高;(3)对HC-Pro和CP保守基序进行了分析。YN9.1具有RITC、PTK、DAG等病毒蚜虫传播保守基序,其中RITC在Potyvirus属病毒中常见形式为KITC;(4)系统进化树分析结果显示,TVBMV进化形成2个组,云南分离物独立进化形成一组,TVBMV进化与地域具有明显的相关性;(5)重组分析发现PY为ZC1和YN的组内重组体,重组位点位于HC-Pro 3'末端和NIb 5'端。      

烟草花叶病毒病的分子鉴定

为了建立烟草病毒病的分子鉴定体系,采用TMV,CMV和PVY3种病毒的检测引物对烟草花叶病样品进行了RT-PCR扩增,并从核酸水平上对病毒基因序列进行了分析。RT-PCR鉴定结果显示,该病害病原为TMV,测序结果显示扩增产物长923bp,序列比对后发现该序列与TMV3个中国分离物的同源性高达97%,序列分析结果表明该段序列位于TMV基因组3'末端,包含部分MP基因、完整CP基因和3'端非编码区。对CP基因进行了系统进化分析,且该序列已成功登陆GenBank。     

湖南烟草病毒病种类检测与系统进化分析

为明确湖南烟草病毒病的种类及分布状况,利用小干扰RNA（siRNA）测序和反转录PCR（RT-PCR）对湖南烟区样品进行检测,分析主要病毒侵染类型,最大似然法构建系统进化树确定分类地位。结果表明,湖南烟草受到烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）、番茄斑驳花叶病毒（Tomato mottle mosaic virus,ToMMV）、地黄花叶病毒（Rehmannia mosaic virus,ReMV）和辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus,PMMV）等6种病毒的侵染,其中ToMMV、ReMV、PMMV首次被检测到,TMV、CMV和PVY是主要病毒,TMV为优势病毒,复合侵染是主要侵染类型,复合侵染率为71.29%;湖南烟草上的TMV分离物形成3个独立组系,CMV分离物属群组I的亚组IB,PVY分离物属PVY^NTN-a、PVY^E和PVY^SYR-I株系。本研究摸清了湖南烟草病毒种类、分布及侵染情况,明确了TMV、CMV、PVY的分类地位,为病毒病的防治提供了理论依据。     

一个与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记

烟草普通花叶病（Tobacco Mosaic Virus,TMV）是烟叶生产的主要病害,为建立烟草抗TMV分子标记辅助选择体系,本研究以高抗TMV烤烟品种Coker176和易感TMV烤烟品种Y3以及它们的BC1F1群体为试材,采用分离集团分组分析法（Bulked Segregation Analysis,BSA）和简单序列重复（Simple Sequence Repeat,SSR）标记技术,筛选与TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记。通过对18764对SSR引物的分析表明,有396对SSR引物在两亲本间有多态,选出1对SSR引物TM508-007扩增出的标记与TMV抗性的N基因紧密连锁,遗传连锁距离为0.41 cM,证实获得的与TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记稳定可靠,可用于烟草抗TMV分子标记辅助选择。      

烟草PVYN辽宁分离物全序列测定与分析

利用引起烟草脉坏死病的马铃薯Y病毒脉坏死株系辽宁分离物（Potato virus Y-vein necrosis strain Liaoning isolate, PVYN-LN）,以GenBank中已有的PVY全序列为基础,设计特异引物。通过总RNA提取、RT-PCR、3’RACE和5’RACE扩增及序列测定,测得PVYN-LN全长基因组序列（NCBI登录号为JQ971975）包括9714个碱基(含PolyA尾),整条序列仅包含一个由9186个碱基组成的开放读码框（ORF）,编码一条包含3061个氨基酸的多聚蛋白。对所得序列进行BLAST,利用MEGA软件对所测得的PVYN-LN全序列与GenBank中已有的PVY全序列及氨基酸进行系统进化分析,发现PVYN-LN分离物与已报道的PVYN株系具有较高的进化亲缘关系,该分离物属于PVYN株系。序列重组分析软件RDP4分析,该序列无重组。     

烟草GA代谢相关基因ga1和ga2的克隆和表达分析

为了解赤霉素（gibberellic acids, GA）在烟草生长发育中的作用,本研究利用同源克隆和RACE技术分离了3个烟草种GA代谢相关基因ga1和ga2的6条序列,对其进行了序列比对和进化分析;并利用荧光定量表达分析研究了其在林烟草和普通烟草中的表达谱。结果表明,相关基因在烟草属和茄科作物中保守性很高;普通烟草中克隆的ga1和ga2可能起源于绒毛状烟草。表达分析表明,ga1和ga2在林烟草生长发育早期和茎伸长期分别在叶和茎中的表达量显著高于其他组织。     

烟草DELLA基因家族的克隆与表达模式分析

为明确烟草受逆境胁迫时DELLA基因家族的转录调节功能,通过烟草EST序列比对分析克隆了3个DELLA基因家族基因（NtDELLA1,NtDELLA2,NtDELLA3）,并对3个基因的结构和表达模式进行了分析。生物信息学分析结果表明,烟草DELLA基因全长1 700 bp左右,其编码蛋白包含DELLA蛋白的特征结构域DELLA基序和VHYNP基序,与拟南芥DELLA蛋白家族的GAI蛋白高度同源,推测烟草DELLA蛋白与拟南芥DELLA蛋白具有类似的功能;荧光定量PCR分析结果表明,这3个基因在烟草不同组织和关键生长发育时期表达模式类似,尤以茎中表达量最高;胁迫应答分析结果表明,烟草DELLA基因的转录对干旱、低温、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）侵染和外源激素均表现出不同程度的响应,其中干旱、赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）可抑制烟草DELLA基因的表达,而低温胁迫可诱导NtDELLA1上调表达,TMV侵染可诱导NtDELLA1和NtDELLA2的大量表达。      

抗马铃薯Y病毒(PVY)和烟草花叶病毒(TMV)单联弱毒疫苗的研制及防效测定

为防治烟草马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）,筛选PVY和TMV基因组中保守且高效表达siRNA的片段,连接到烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV）弱毒侵染性克隆,制备成单联弱毒疫苗,获得TVB-PVYF1、TVB-PVYF2、TVB-PVYF3和TVB-TMVF1、TVB-TMVF2、TVB-TMVF3共6个单联弱毒疫苗。室内筛选后选取保护效果最好的TVB-PVYF2和TVB-TMVF3两个单联弱毒疫苗在山东临沂、潍坊和黑龙江哈尔滨等地进行了田间防效测定,TVB-PVYF2对黑龙江哈尔滨、山东临沂和潍坊烟草PVY的相对防效分别为66.88%、76.46%和60.71%,TVB-TMVF3对黑龙江哈尔滨、山东临沂和潍坊烟草TMV的相对防效分别为80.74%、87.34%和74.40%。      

卷烟携带烟草普通花叶病毒(TMV)的测定研究

对国内15个省市34个卷烟厂家64个品牌的卷烟样品生物检测结果表明,TMV检出率为67.69%;不论是混合型还是烤烟型以及不同等级的卷烟样品都可以检出。卷烟烟丝研磨液和不同浓度的TMV汁液一样,接种后足以导致烟苗发病。      

烟草中抑芽丹残留量的测定

采用ISO 4876-1980规定的方法测定了239个国产烟叶、49个进口烟叶和12个进口卷烟样品中的抑芽丹残留量。结果表明:国产烟叶抑芽丹的检出率为6.69%,最高54.00mg/kg,最低1.50mg/kg,平均6.82mg/kg;进口卷烟检出率为58.33%,最高42.75mg/kg,最低7.75mg/kg,平均17.57mg/kg;进口烟叶检出率为30.61%,最高14.00mg/kg,最低1.50mg/kg,平均5.63mg/kg。     

全二维气相色谱飞行时间质谱分析烤烟半挥发性中性化学成分

用全二维气相色谱飞行时间质谱(GC×GC-TOFMS)和GC-MS分析了同时蒸馏萃取得到的烤烟中性组分,建立了烟草挥发性、半挥发性中性化学成分分析的GC×GC-TOFMS方法。以云南楚雄产云烟85C₃F烟叶为例,进行了GC×GC-TOFMS与GC-MS在分离能力、灵敏度和族分离方面的对比,结果显示:①GC×GC-TOFMS的灵敏度提高了10-82倍;②GC×GC-TOFMS的分离能力大大提高,在1DGC-MS上峰形很好的一个峰,被GC×GC-TOFMS分离出8种成分,因此定量更加准确;③C₁、C₂、C₃、C₄取代萘因性质不同而在全二维谱图上明显地分为不同的族。可见,GC×GC-TOFMS在分离、定性定量和族分离方面与GC-MS相比有明显的优势;④比较了国内6个主要烟叶产地云烟85的部分半挥发性中性成分的含量,结果显示:烟草中性化学成分的含量与各产地的土壤、气候条件有关,以湖北恩施最高,其次是云南楚雄、贵州遵义、河南内乡、福建连城、山东安丘,但总量相差不大。      

应用16S rDNA克隆文库技术分析陈化烟叶细菌多样性

为较全面地分析陈化烟叶的细菌多样性,利用16S rDNA基因克隆文库技术分析了产自于福建的3个等级处于不同陈化阶段的12个烟叶样品中的细菌组成.采集C/S挑、B22、X21三个等级的陈化烤烟烟叶,陈化时间分别为3、6、12、24个月.实验结果表明,烤烟烟叶在陈化过程中共存在25种细菌,γ-变形菌纲(Gamma-proteobacteria)细菌种类最丰富,含有19种细菌,α-变形菌纲(Alpha-proteobacteria)含有3种细菌,芽孢杆菌纲(Bacilli)含有2种细菌,β-变形菌纲(Beta-proteobacteria)含有1种细菌.在12个烟叶样品中,肠杆菌属(Enterobacter)在8个样品中的比例最高,假单胞菌属(Pseudomonas)在2个样品中比例最高,泛菌属(Pantoea)和克洛诺菌属(Cronobacter spp.)分别在样品B6和C3中比例最高.在陈化过程中,烤烟叶面细菌组成没有明显的变化规律.     

楚雄州烟草昆虫种类及危害调查研究

经４年调查研究，基本查清楚雄州烟草田间昆虫及软体动物有２个纲１０个目５６科１９７种，其中发现１２种烟草新害虫；查到害虫天敌昆虫有１个纲７个目１５科４２种；查到烟库害虫１个纲２个目８科８种。基本查清了烟草主要害虫发生及危害情况，为今后制定和实施２烟草害虫防治措施提供了科学依据。