多腺毛烟草K326品种基因编辑材料的创制与分析

烟草腺毛与烟株抗性和烟叶品质密切相关。为了定向改良烟草腺毛密度、创制多腺毛烟草材料,以烟草品种K326为材料,利用CRISPR-Cas9技术对腺毛发生负向调控基因NtCycB2进行敲除,创制了多腺毛K326定向改良材料HK326(Hairy K326),并分析了NtCycB2基因敲除对烤烟农艺性状和化学成分的影响。结果表明:NtCycB2基因敲除后烟株发育正常,生长旺盛,农艺性状与对照相比无明显变化;烟草叶面腺毛密度显著提高,分泌型腺毛发育完善,物质合成和分泌旺盛,西柏烷二萜化合物含量显著提高;烤后烟叶中性香气成分总量增加,其中,茄酮及新植二烯类成分增幅最为明显。因此,NtCycB2基因的敲除,不仅能够提高烟草的腺毛密度,而且对烟株生长发育和重要香气物质的积累也有促进作用,在烟草品种改良中具有较大的应用潜力。     

NtCycB2基因表达对烟草抗旱性的影响

NtCycB2参与调控烟草腺毛的发生与发育过程,并对多种非生物胁迫具有应答反应.为阐明NtCycB2表达对烟株耐旱性的影响,以敲除NtCycB2后的多腺毛株系ko(NtCycB2-ko)、NtCycB2过表达的少腺毛株系oe和烟草栽培品种K326为材料,使用不同浓度聚乙二醇(PEG-6000)在试管中模拟干旱胁迫,同时...     

烟草NtCycB2启动子的克隆和组织驱动特性分析

【背景和目的】烟草B型细胞周期蛋白CycB2可以负调控腺毛的发生，为分析烟草Nt CycB2启动子的组织驱动特性。【方法】通过实时定量PCR分析普通烟草NtCycB2-1和Nt CycB2-2两种序列的组织表达差异，克隆NtCycB2-1和NtCycB2-2启动子序列，对其进行进化分析、顺式元件预测和组织驱动特性分析。【结果】（1）烟草NtCycB2-1和NtCycB2-2均为腺毛优势表达基因，NtCycB2-1的表达量显著高于NtCycB2-2;(2)普通烟草中存在两种NtCycB2启动子序列类型（ProNtCycB2-1和ProNtCycB2-2），其中ProNtCycB2-1来自于林烟草，ProNtCycB2-2来自于绒毛烟草，这些CycB2启动子中普遍存在ABRE等激素应答元件，以及MYB-motif、MYC-motif和TC-rich repeats等逆境响应元件；（3）以GUS为报告基因，研究NtCycB2-1和NtCycB2-2两个启动子的组织驱动特性发现，NtCycB2-1和NtCycB2-2启动子均能驱动GUS基因在叶片和茎部腺毛中特异表达，其中NtCycB2-1启动...     

烤烟Y2001多腺毛改良株系的创制及抗性分析

为进一步提高Y2001腺毛分泌物含量（质量分数），采用EMS诱变方法创制了Y2001腺毛发生负调控基因NtCycB2的突变体，并以Y2001为轮回亲本进行连续回交，获得了多腺毛定向改良株系HY2001。对腺毛观察发现，与中烟100相比HY2001表皮毛总密度增加117%，其中长柄和短柄腺毛密度显著提高，而非分泌型表皮毛密度显著降低；与Y2001相比HY2001表皮毛总密度增加77%，其中长柄和短柄腺毛密度显著提高，非分泌型表皮毛密度也有小幅度提高。叶面化学成分分析表明，HY2001与中烟100、Y2001腺毛分泌物组分相同，但分泌物含量显著提高，其中西柏烷二萜含量分别为中烟100和Y2001的3.03倍和1.98倍，蔗糖酯含量分别为中烟100和Y2001的3.43倍和2.63倍；HY2001中二萜合成相关基因NtCBTS、NtCYP71D16、NtABS及糖酯合成相关基因NtASAT1、NtASAT2表达量也有一定的上调。干旱胁迫试验发现，胁迫处理下HY2001植株及叶片萎蔫程度比Y2001减轻，植株抗氧化能力显著提高；黑胫病抗性试验发现，接种疫霉后，HY2001植株茎基部发病程度弱于...     

烟草腺毛生物反应器材料的创制与性状分析

为提高烟草腺毛分泌物含量（质量分数），以高分泌型种质资源T.I.1068为材料，采用基因编辑技术敲除其腺毛发育负调控基因NtCycB2，获得了纯合突变株系TTB-1(tobacco trichome bioreactor-1)。结果表明：TTB-1植株生长旺盛，发育正常。显微观察发现与烤烟K326不同，TTB-1与T.I.1068表皮毛由腺毛组成，无保护毛；TTB-1腺毛密度比T.I.1068提高53.41%，是K326的7倍；与K326相比，TTB-1腺头更加饱满，罗丹明着色更深。烟株现蕾期中部叶片叶面化学成分检测结果显示，TTB-1与T.I.1068分泌物组分一致，但分泌物含量显著高于T.I.1068，分泌物总量比T.I.1068提高63.11%;TTB-1与K326分泌物组分不同，除西柏烷类二萜和Ⅰ～Ⅱ型蔗糖酯外，还含有赖百当类二萜和Ⅲ～Ⅴ型蔗糖酯，总量是烤烟品种K326的7.95倍。对上中下部成熟叶片进行分批采收和叶面化学成分萃取，浸膏产率分别为烟叶鲜质量的0.61%、0.43%、0.30%，平均每株浸膏产量为8.90 g；在盛花期进行一次性采收，浸膏产率为烟叶鲜质量的0.45...     

NtCycB2和NtJAZ1共敲除对烟草腺毛密度和烟碱含量的影响

为了提高烟草的腺毛密度、腺毛分泌物和烟碱含量,从而改善烟株抗性和烟叶品质,以NtCycB2突变的多腺毛K326突变株系（hairy K326）为材料,采用CRISPR/Cas9技术对NtJAZ1进行基因编辑,筛选出NtCycB2与NtJAZ1基因共敲除的纯合株系J-21,并以K326和hairy K326为对照,对J-21的农艺性状、腺毛发育、烟碱生物合成和烟叶化学成分进行了研究。结果表明,J-21植株生长发育正常,主要农艺性状与K326和hairy K326无显著差异,其叶片腺毛密度比hairy K326有所降低,但比K326显著提高,腺毛分泌物含量（质量分数）提高156.35%。J-21叶片烟碱含量在现蕾期比K326和hairy K326显著提高,在烟株打顶后提高幅度明显降低,成熟期叶片烟碱含量比K326和hairy K326分别提高37.14%和32.28%。J-21烤后烟叶化学成分协调,烟碱含量比K326和hairy K326分别提高39.81%和45.32%,西柏烷类降解产物茄酮含量比K326和hairy K326分别提高217.49%和48.45%。表明NtCycB2和Nt...     

外源MeJA诱导烟草叶面防御反应

以中烟100为材料,研究了茉莉酸甲酯(MeJA)喷施后,烟草叶面腺毛密度类型、腺毛分泌物合成积累及叶片对蚜虫抗性的变化规律,探讨了烟草叶面腺毛的防御反应模式和作用机制。结果表明,MeJA处理后,烟草叶片对蚜虫的驱避作用明显增强,新生叶片叶面腺毛密度增加,尤其是长柄多细胞腺头腺毛密度的变化达到显著水平。GC/MS分析表明,MeJA处理使叶面分泌物含量增加,并在处理后第7天达到最大值。其中,西柏烷类二萜化合物含量增幅最大。但RT-PCR分析发现,西柏三烯一醇合成酶基因(CBT)、西柏三烯一醇羟化酶基因(CYP71D16)在转录水平上并没有明显变化,表明烟草叶面腺毛物质的合成和分泌可能具有复杂的转录后调控机制。     

茉莉酸甲酯对烟草分泌型和非分泌型腺毛形态发生的影响

为解析茉莉酸对烟草腺毛发生的影响,本文以高分泌型普通烟草T.I.1068和非分泌型普通烟草T.I.1112为材料,喷施不同浓度茉莉酸甲酯（MeJA）,并对处理前后的叶片和茎表面腺毛进行形态学比较观察。结果发现:（1）T.I.1068腺毛包括长柄分泌型和短柄分泌型两类,腺毛密度随着MeJA浓度的增加而增加,但腺毛类型保持不变。（2）T.I.1112腺毛包括非分泌型和短柄分泌型两类,长柄分泌型腺毛在MeJA处理后出现,其密度随MeJA浓度的增加而增加,而非分泌型腺毛和短柄分泌型腺毛的密度并无明显变化。该结果表明,MeJA对烟草长柄分泌型腺毛发生具有强烈的诱导作用,而对非分泌型腺毛的发生并无明显影响,反映出不同类型的烟草腺毛具有不同的发生调控机制。      

低浓度茉莉酸甲酯对烟草长柄腺毛发生发育的影响

茉莉酸甲酯（MeJA）对烟草长柄腺毛的发生具有强烈的诱导作用,但浓度过高时会抑制烟苗发育。本文以云烟87幼苗为材料,研究低浓度MeJA对腺毛发育和腺毛分泌物的影响,并利用qRT-PCR技术研究腺毛发生发育调控基因对MeJA的应答模式。结果表明,随着MeJA喷施浓度的升高,长柄腺毛的密度和腺头直径逐渐增加;喷施300μmol/L MeJA对长柄腺毛发生和发育有显著的诱导作用,且对叶片发育无明显影响;当MeJA喷施浓度达到600μmol/L时,叶片发育受到抑制。叶面化学成分分析发现,与未喷施MeJA的对照相比,喷施300μmol/L MeJA后西柏烷二萜、烷烃和蔗糖酯含量增加约一倍。基因应答模式研究发现,西柏烷二萜合成基因CBTS和CYP71D16,以及酯转运蛋白基因Nt LTP1受MeJA诱导表达;烟草腺毛发生调控基因ARF3、GIS、CD2、Wo和Cyc B2对MeJA处理均具有应答反应,其中ARF3和GIS的表达受到MeJA诱导,而CD2、Wo和Cyc B2的表达受到MeJA抑制。综上,300μmol/L MeJA可以调控腺毛发育相关基因的表达,安全、有效地促进长柄腺毛发生发育以及腺...     

烟草腺毛发生和发育相关基因

烟草(Nicotiana tabacum L.)腺毛丰富、类型多样、分泌旺盛,对烟株抗性和烟叶香气品质具有重要影响。对近年来烟草腺毛发生和发育、腺毛分泌物合成相关基因的研究进展进行了综述,并展望了其在烟草叶面化学定向调控和品种改良中的应用潜力。     

高分泌型无赖百当烟草8306突变材料的创制与分析

8306是具有晾晒烟风格的烤烟育种材料.在前期试验中创制了NtCPS2基因突变株系8306-1,抑制了晾晒烟风格代表性物质赖百当二萜的合成.为进一步提高8306-1株系中西柏烷二萜和蔗糖酯含量(质量分数),采用基因编辑技术对8306-1株系的NtCycB2基因进行敲除,获得了纯合突变株系8306-2.与8306、830...     

白肋烟烟叶表皮腺毛密度品种间的差异性研究

研究了白肋烟上部叶和中部叶的上表皮、下表皮和全表皮腺毛密度在不同品种间的差异。结果表明,白肋烟烟叶腺毛以长柄腺毛、短柄腺毛和无头腺毛为主,烟叶各类型腺毛密度在不同品种、同一品种不同部位及同一部位的上下表皮间存在一定差异。烟叶总腺毛密度中部叶高于上部叶,上表皮高于下表皮。上部叶的上表皮总腺毛密度以品种JB04-05的最大,下表皮总腺毛密度以品种22081和23014的最大,上部叶总腺毛密度以22084和JB04-05的最大,鄂烟1号的密度最小。中部叶的上表皮总腺毛密度以22081和22084的最大,下表皮及全表皮总腺毛密度以22074、22081和22084的最大。     

烟草“8306”NtCPS2基因敲除及叶面化学成分改良

8306是重要的高香气烤烟育种材料,因其腺毛分泌物中含有赖百当化合物而使其杂交后代具有晾晒烟香气特征。为此,本研究利用CRISPR/Cas9技术,对8306中赖百当生物合成途径的关键酶基因NtCPS2进行敲除,获得了gRNA区发生单碱基插入突变导致翻译提前终止的纯合突变体8306-1。与8306相比,该突变株系生长发育正常,腺毛类型和腺毛密度无显著变化;利用GC-MS技术对叶面化学成分进行检测,在8306-1中并未发现8306中所含有的顺冷杉醇和赖百当二醇等赖百当类化合物,而腺毛分泌物的其他主要成分,如西柏三烯一醇、西柏三烯二醇及蔗糖酯的含量与对照相比并无明显变化;RT-PCR检测分析显示,8306-1与8306中MEP途径及二萜生物合成途径的关键基因,如NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtGPPS、NtGGPPS、NtCYC、NtCYP71D16等在转录水平上的表达均无明显差异。该研究结果表明,NtCPS2基因敲除能有效降低烟草赖百当类二萜化合物的含量,而对叶面其他化学成分及类萜途径基因表达无明显影响。因此,NtCPS2基因是进行烟草叶面化学成分定向改良的理想靶点,对烤烟高香气育种具有重要意义。      

典型烤烟品种腺毛形态及分泌特性比较分析

为探讨烤烟叶面化学特征及其形成机制,本文以K326、红花大金元、中烟100、翠碧1号、豫烟11等代表性烤烟品种为试验材料,采用超景深显微技术、GC-MS分析检测技术和荧光定量PCR技术,对叶面腺毛形态、叶面化学成分以及腺毛分泌物合成关键基因表达进行了比较分析。结果发现:（1）烤烟腺毛由长柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛和非分泌保护毛等不同类型组成,翠碧1号和豫烟11中分泌型腺毛含量较高,而中烟100中非分泌型腺毛相对丰富。（2）西柏烷类化合物是烤烟叶面的主要化学成分,以K326中的含量为最高;赖百当类化合物在烤烟中含量极少,但豫烟11中顺冷杉醇和赖百当二醇含量较高。（3）西柏烷类合成酶关键基因CYC和CYP71D16在K326中表达活跃,赖百当合成酶关键基因CPS2在豫烟11中的表达量明显高于其它品种。不同烤烟品种之间叶面腺毛形态、基因表达及分泌物含量所存在的明显差异,可能与品种特色密切相关。      

高分泌型K326近等基因系的创制和鉴定

烟草腺毛分泌物含量与烟叶品质和烟株抗性密切相关.本研究以K326为轮回亲本,以高分泌型烟草种质T.I.1068为供体亲本,通过对腺毛形态及腺毛分泌物含量的定向筛选,获得了高分泌型的K326近等基因系(High Secretory K326,HSK326).形态观察发现,HSK326植物学性状与K326基本一致,但叶面腺...     

低氮胁迫对烟草生物学性状、生长素及NtPINs基因家族的影响

为了探究低氮胁迫下烟株体内生长素的分布对烟草根系发育和腺毛发生的影响,以DR5::GUS转基因烟草为材料,通过沙培试验研究低氮胁迫对烟株生物量、全氮含量、叶片及根系发育、生长素浓度、叶片腺毛密度以及生长素极性运输蛋白NtPINs家族基因表达的影响。结果表明:与对照处理（NH₄NO₃:2.5 mmol/L）相比,低氮胁迫下（NH₄NO₃:0.25 mmol/L）烟草上部叶、茎及根部生物量显著下降,地上部全氮含量降低30%,根系全氮含量降低40.2%,上部叶腺毛密度增加13.9%,中部叶和下部叶腺毛密度分别降低40%和31.9%,上部叶生长素含量增加26%,中部叶和根系生长素分别下降7.1%和13.1%;qRT-PCR结果表明,低氮胁迫下烟草根系中NtPIN1、NtPIN4、NtPIN9的基因表达水平分别降低了40%,55%,65%,与对照相比差异均有统计学意义（P < 0.05）。结论:低氮胁迫下烟草叶片腺毛的发生及根系的构型发生改变与体内生长素从地上部（上部叶、中部叶、下部叶）到根系极性运输减少密切相关。      

不同类型肥料对烤烟叶片腺毛密度、种类及分布规律的影响

通过盆栽和大田试验,对不同类型肥料处理的烤烟叶片腺毛密度、种类和分布规律进行了研究分析。结果表明:(1)腺毛密度在不同叶位叶片上和同一叶片的分布规律不受肥料因素影响,是由品种自身的遗传特性决定的;(2)腺毛类型在叶位之间的分布差异表现为:多细胞腺头腺毛相对较多地分布于中上部叶片,尤其是短柄多细胞腺头腺毛,在上部叶片存在明显的分布优势,而长柄分枝腺毛则相反;(3)就烤烟整株而言,长柄腺毛是主要类型,在成熟叶片上占绝对优势,对烟叶香气品质的贡献也最大;(4)不同类型肥料对烟叶腺毛密度影响很大。饼肥和腐殖酸与化肥配合使用,能显著提高烤烟叶片腺毛密度,但二者在不同叶位上对不同种类的腺毛作用效果不一样。      

Q型烟粉虱对9个烟草品种的趋性

Q型烟粉虱是近年来危害烟草的主要害虫之一,为明确我国烟区主栽烟草品种对Q型烟粉虱抗性水平的差异,实验室条件下,研究了其在9个不同烟草品种上的选择趋性、72 h产卵量、与叶片背面绒毛密度的相关性以及烟草叶片挥发物对其选择趋性的影响。结果表明,Q型烟粉虱成虫对烟草品种的选择性、产卵趋性在9个烟草品种间差异显著,烟草叶片背面绒毛密度与Q型烟粉虱产卵量具有显著相关性,其中NC71上的成虫数（8.22头/株）、产卵量（135粒/株）、叶背绒毛密度（164.67个/cm²）均最低。进一步利用Y嗅觉仪测定Q型烟粉虱对云烟97、中烟104、NC89、NC71烟草品种叶片气味及其提取物的行为反应,结果显示,NC71叶片及其提取物对Q型烟粉虱具有明显驱避作用（烟粉虱对其趋性分别为24.67%和13.33%）。NC71对Q型烟粉虱成虫选择性、产卵选择性抗性较强,具有在植烟区推广种植潜力。