CRISPR/Cas9介导的低产尿素黄酒酵母工程菌的构建

通过代谢工程改造构建低产尿素的酿酒酵母工程菌,从根源上减少黄酒发酵液中尿素的含量及氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)的形成。该研究利用融合PCR构建DUR3过表达组件"HOL-PGK1p-DUR3-PGK1tHOR",通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术转化酿酒酵母S. cerevisiae NaDUR1,2-Δcar1,在敲除CAR1和过表达DUR1,2基因的基础上过表达DUR3基因,获得工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1。实验室黄酒发酵实验结果表明,与亲本菌株S. cerevisiae Na相比,工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了92. 1%,EC含量降低了58. 6%;与出发菌株S. cerevisiae NaDUR1,2-Δcar1相比,工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了43. 4%,EC含量降低了16. 2%。过表达DUR3的工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1具有"尿素吸收"的能力,减少EC的形成。借助CRISPR/Cas9系统,构建的酵母工程菌无外源抗性基因的引入,具有工业化应用的潜在可能性。     

CRISPR/Cas9介导的果糖低消耗酿酒酵母工程菌的构建

利用酿酒酵母为宿主,以果糖为原料合成D-阿洛酮糖具有食品方面的先天优势。为了减少酿酒酵母宿主本身对果糖的消耗,对酿酒酵母的己糖激酶同工酶2(Hexokinaseisoenzyme2,hxk2)基因进行编辑。本研究采用CRISPR/Cas9技术,构建了Cas9和gRNA共表达质粒p YES2-CG-Δhxk2,以酿酒酵母BY4741为出发菌株,URA3为筛选标记,采用高效电击转化法和胞内同源重组技术,获得hxk2基因缺陷株BY4741-Δhxk2。在此基础上,进行果糖发酵实验以评估突变菌株的果糖消耗速率。实验结果显示,发酵培养14 h时,缺陷株BY4741-Δhxk2果糖消耗速率为3.35 mg/h;与野生型菌株相比其下降了6.42%。此外,发酵培养22 h,BY4741-Δhxk2的OD600nm值为8.65,相比于野生型提高了6.40%。研究表明,己糖激酶hxk2基因的缺陷编辑可以一定程度降低酿酒酵母对果糖的利用,同时缺陷株较野生型表现出一定的生长优势,这为后续以酿酒酵母为宿主生产D-阿洛酮糖奠定了初步基础。     

基于CRISPR/Cas9系统的金针菇基因组编辑载体构建

采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9,构建金针菇基因Mads-8敲除载体及转化体系。以转录组数据为依据,通过分析基因Mads-8序列信息,选择高效的靶位点序列,同时加入筛选标记基因hph构建过渡载体sgRNA-T,通过菌落PCR鉴定和测序来验证靶位点序列是否正确插入。以表达载体pg Fvs-cas9为框架,酶切连接后构建重组敲除载体pg Fvs-Cas9-gRNA,PCR和酶切鉴定敲除载体。再以PEG介导的金针菇原生质体转化表达载体,在潮霉素抗性平板上筛选拟转化子,以拟转化子基因组DNA为模板扩增Cas9基因。结果显示,靶位点序列成功插入敲除载体且序列正确,重组质粒成功转化进金针菇的基因组。对金针菇基因组敲除载体的构建,为后续金针菇相关基因的功能验证及育种研究提供载体材料及理论依据。      

基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记

乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。     

基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记

乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。     

CRISPR/Cas生物传感器检测食源性病原体的研究进展

食源性病原体引起的食源性疾病严重威胁着人类的健康,灵敏且快速检测食源性病原体成为预防疾病发生的重要手段。生物传感器具有灵敏度高,无需富集即可实时定量,易于现场检测等优点。CRISPR/Cas系统与生物传感器结合可提高生物传感器检测的灵敏度和准确性。本文介绍CRISPR/Cas系统的分类及作用机制,回顾基于CRISPR/Cas的各种生物传感器检测食源性病原体的方法,包括荧光传感器、电化学传感器和侧流层析试纸,分析应用不同Cas蛋白检测的优缺点,为食源性病原体的检测提供借鉴。     

基于CRISPR/Cas9技术的烟草烟碱相关基因敲除及功能研究

CRISPR/Cas9是一种重要的基因组定向编辑技术,近年来在植物基因组的定向敲除和分子育种材料创制中得到了广泛应用。为了发掘可用于分子育种的低烟碱烟草,以烤烟品种K326为试验材料,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对控制烟草烟碱合成和转运的5个基因（PMT1、QPT1、A622、NtNUP1和JAT1）进行定向敲除,并对T2代纯合基因型烟草植株进行烟碱含量检测。结果表明,定向敲除5个基因后获得100株成功编辑的T0代烟草植株,突变检出率为29.9%,突变类型以单碱基插入或删除为主。对定向敲除烟碱合成基因QPT1和转运基因JAT1的T1代纯合基因型烟草植株进行序列分析,发现存在4种突变类型,分别是插入一个T、C、A碱基的插入突变和一个缺失44个碱基的缺失突变,从而引发移码使得翻译的氨基酸链大幅缩短,其T2代植株上部叶烟碱含量显著低于野生型植株。综上所述,CRISPR/Cas9技术能够高效定向敲除烟碱关键基因,为低烟碱烟草分子育种提供了理论和技术支撑。     

CRISPR/Cas系统在食源性致病菌快速检测新技术中的研究进展

食源性致病菌的早期筛查与快速检测对食品安全和临床诊断至关重要。然而,传统检测方法操作繁琐、费时费力,难以满足快速检测需求。成簇、规则间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）和关联蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）组成的CRISPR/Cas是广泛存在于细菌和古细菌中的一种免疫系统,其高效特异序列识别及切割活性的特性,为食源性致病菌高灵敏、快速检测提供了一种新的途径。本文介绍了CRISPR/Cas系统的原理、机制及发展,总结了近年来基于CRISPR/Cas系统结合不同结果报告方式用于食源性致病菌快速检测的最新进展,并对其优势、局限性和未来发展方向进行了讨论。     

CRISPR/Cas技术在乳酸菌中的研究进展

乳酸菌是重要的食品发酵剂,其传统的基因遗传操作技术为同源重组,该技术为后续的基因编辑工作奠定了基础,但是也存在操作繁琐、效率低等不足。成簇的规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated protein, Cas)以其高效、便捷性推动了乳酸菌基因编辑的发展。该文综述了CRISPR的原理、分类,重点阐述了CRISPR操作系统在乳酸菌方面的应用。     

编辑烤烟多酚氧化酶基因NtPPO8后的效应分析

【目的】探究NtPPO8基因在烟草中的功能以及对烟叶耐烤性和烤后烟质量的影响。【方法】以烤烟品种NC89为材料,利用CRISPR/Cas9技术对NtPPO8进行定向编辑,获得纯合突变植株,测定并分析原品种和突变体在叶龄60 d时的基因表达量和植物多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）活性差异,探究NtPPO8基因对烘烤过程中的PPO活性以及烤后烟的多酚物质含量的影响。【结果】（1）共获得6株T0代纯合突变体,突变均发生在靶位点上,为1个碱基的插入突变。（2）4个T1代编辑株系的NtPPO8表达水平显著下降,所有编辑株系的PPO活性显著下降。（3）T1代编辑株系烘烤过程中的PPO活性低于原品种,烤后中部叶总酚含量显著高于原品种。【结论】定向编辑NtPPO8基因后,降低了其在烟叶中的表达量,抑制了烟叶在烘烤过程中的PPO活性,有助于烤后烟多酚类物质的积累。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶类似基因的克隆及其功能研究

利用同源克隆法从普通烟草(Nicotiana tabacum)红花大金元的cDNA 中克隆到一个新基因NtGGPPSL(Geranylgeranylpyrophosphate synthase-like),其编码区全长为813 bp。Blast 结果显示该基因与林烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)和番茄(Solanum lycopersicum)的GGPPS 小亚基基因的相似度分别达到了99%、91% 和82%,但其编码的蛋白质序列缺失了GGPPS小亚基的关键功能域“DDXXXXD”,这表明NtGGPPSL 基因的功能可能与GGPPS 小亚基基因不同。为了深入研究NtGGPPSL 基因的功能,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析NtGGPPSL 基因在普通烟草不同时期和器官中的表达差异。利用TRV 病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中NtGGPPSL基因的表达,在成功沉默该基因之后,检测烟草中质体色素(新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素)含量的变化。结果显示,NtGGPPSL 基因在茎和根中的表达量明显高于其他器官。与对照组相比,在NtGGPPSL 基因沉默后,烟草叶片发生明显的褪绿现象,质体色素含量显著降低,表明该基因参与了叶绿素的合成,这为VIGS 体系提供了一个可参考的指示基因,也为烟草的遗传改良和基因功能研究提供了理论依据。      

普通烟草SWEET基因家族的鉴定与表达分析

  目的  为挖掘参与烟草糖代谢的SWEET（sugar will eventually be exported transported）基因家族成员。  方法  以拟南芥SWEET蛋白为参考,利用生物信息学方法,对栽培烟草的SWEET蛋白家族进行鉴定,分析蛋白理化性质、系统进化、染色体定位、基因结构和顺式作用元件,对其在不同组织和不同胁迫处理的表达模式进行检测。  结果  从普通烟草中鉴定到70个可能的SWEET基因,系统发育树将其划分为4个亚家族,大多数烟草SWEET基因在进化过程中经历纯化选择。不同烟草组织的表达模式分析显示,一些烟草SWEET基因具有组织表达特异性。不同胁迫处理的表达模式分析显示,部分烟草SWEET基因在葡萄糖、蔗糖、低温、干旱或者是盐胁迫处理下表达量变化明显。  结论  Ntab0097340和Ntab0727890是烟草植株重要的响应干旱与低温胁迫的基因,本研究为深入研究烟草SWEET基因功能提供有价值的参考信息。      

烟草NtGCN2启动子的克隆及功能研究

[目的]探究烟草蛋白激酶NtGCN2启动子驱动GUS基因在ABA、SA、AZA和MeJA四种处理下的表达模式.[方法]克隆烟草NtGCN2上游2000bp的启动子序列,并采用Plant CARE和PLACE数据库进行顺式作用元件预测.构建NtGCN2启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的融合表达载体并转化烟草K32...     

烟草脱落酸受体基因NtPYR1和NtPYL9的克隆及表达模式分析

为揭示烟草脱落酸(ABA)受体基因NtPYR1和NtPYL9的生物学功能,以拟南芥PYR1和PYL9基因为探针,在NCBI中通过同源比对查找普通烟草表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)序列,将EST序列进行拼接并设计特异性引物,从普通烟草红花大金元c DNA文库中克隆出NtPYR1和NtPYL9基因,其开放阅读框长分别为678 bp和564 bp,分别编码225个和187个氨基酸。NtPYR1和NtPYL9蛋白都具有一个保守的疏水性结构域,同属于PYR/PYL/RCAR ABA受体基因家族,NtPYR1和NtPYL9与番茄同源蛋白的相似性分别达到79.10%和95.24%。遗传聚类分析结果显示:NtPYR1和NtPYL9与番茄和马铃薯同源基因的遗传进化距离最近,说明PYR1和PYL9在茄科植物中较为保守。定量PCR对烟草不同组织表达模式分析表明,NtPYR1和NtPYL9在烟草不同组织中均有表达,分别在子叶和须根中的表达量最高。NtPYR1和NtPYL9表达均受ABA抑制,同时受H₂O₂诱导,说明两基因可能参与烟草的抗逆生理过程。      

新鉴定高抗TMV普通烟草枯斑资源的N导入片段长度多样性

为了解我国普通烟草（Nicotiana tabacum）资源对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）的抗性基因状况,为烟草抗病育种的亲本选择提供信息,利用N基因特异分子标记鉴定出携带N基因的普通烟草资源,并采用N导入片段的特异分子标记鉴定了N导入片段的长度。结果表明,供试的63份接种TMV表现枯斑的普通烟草（简称普通烟草枯斑资源）可划分为3大类型,分别为Coker176类型:GL3.50和GL4.06标记阴性、TN4.39、TN5.226、TN5.51标记阳性;Samsun NN类型:GL3.50、GL4.06、TN4.39、TN5.226标记阳性,TN5.51阴性;Xanthi nc类型:GL3.50、GL4.06、TN4.39、TN5.226、TN5.51标记阳性。402等51份资源的N导入片段长度属于Coker176类型,Ky160等2份资源的N导入片段长度属于Samsun NN类型。Ky52等10份资源的N导入片段长度属于Xanthi nc类型。N导入片段较短的枯斑资源,推测其连锁累赘可能较小,育种利用潜力较大。本文较系统地鉴定了普通烟草抗TMV的枯斑资源的N导入片段长度,可为抗TMV种质资源的育种利用提供参考。      

烟草硝酸盐转运蛋白NtNRT1.5基因的克隆及功能分析

【背景和目的】低亲和硝酸盐转运蛋白NRT1家族基因在植物吸收和转运硝态氮过程中发挥重要作用,为研究烟草NRT1家族基因在烟草氮素利用中的作用。【方法】从栽培烟草品种K326中克隆获得NtNRT1.5的全长cDNA序列,利用生物信息分析、qRT-PCR技术和转基因技术系统分析NtNRT1.5基因的序列特征、表达模式及在提高烟草氮素利用效率方面的功能。【结果】NtNRT1.5全长序列包含1800bp开放阅读框、编码599个氨基酸,编码的蛋白质具有NRT基因家族的共有结构特征,与拟南芥AtNRT1.5相似性达到59.28%。亚细胞定位结果表明NtNRT1.5蛋白定位在细胞膜上,其启动子中包含多个与硝酸盐（A(C/G)TCA）、胁迫（MYB）、根系特异表达（ROOT MOTIF BOX）相关的响应元件。表达模式分析结果表明NtNRT1.5主要在根部表达,其次是衰老叶片和茎,新叶基本不表达;低氮抑制其在根系中的表达,说明NtNRT1.5主要负责正常条件下的硝酸盐的吸收;低氮条件下,NtNRT1.5过表达显著提高了转基因烟株的氮素利用率。【结论】NtNRT1.5基因在烟草氮素的吸收和转运上行使重要...     

烟草硝酸还原酶基因NIA1启动子互作蛋白的筛选

硝酸还原酶是植物氮同化过程中的关键酶和限速酶。为更好地调控硝酸还原酶基因的表达,本实验克隆了烟草硝酸还原酶基因NIA1上游938bp的启动子区域,构建了烟草cDNA基因表达文库,应用酵母单杂交技术筛选NIA1启动子序列互作蛋白。通过序列测定和生物信息学分析,共筛选出9个互作蛋白cDNA。其中,功能不明确的预测蛋白7个,具有明确功能信息的蛋白2个,分别为含有CRM结构域的CFM3蛋白（No.71）,和烟草亚硫酸盐氧化酶类似蛋白Sulfite oxidase-like蛋白（No.126）。这些蛋白均为NIA1启动子序列互作蛋白,可能作为转录因子参与NIA1基因的转录调控过程。      

CRISPR/Cas9-RNA interference system for combinatorial metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae

The yeast Saccharomyces cerevisiae is widely used in industrial biotechnology for the production of fuels, chemicals, food ingredients, food and beverages, and pharmaceuticals. To obtain high-performing strains for such bioprocesses, it is often necessary to test tens or even hundreds of metabolic engineering targets, preferably in combinations, to account for synergistic and antagonistic effects. Here, we present a method that allows simultaneous perturbation of multiple selected genetic targets by combining the advantage of CRISPR/Cas9, in vivo recombination, USER assembly and RNA interference. CRISPR/Cas9 introduces a double-strand break in a specific genomic region, where multiexpression constructs combined with the knockdown constructs are simultaneously integrated by homologous recombination. We show the applicability of the method by improving cis,cis-muconic acid production in S. cerevisiae through simultaneous manipulation of several metabolic engineering targets. The method can accelerate metabolic engineering efforts for the construction of future cell factories.