酸冷胁迫下保加利亚乳杆菌定量PCR内参基因的筛选

实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确等优点,被广泛应用于目的基因表达的定量分析,而筛选表达水平稳定的内参基因是提高qRT-PCR结果准确性的重要前提。保加利亚乳杆菌既是酸奶发酵剂的常用菌种,又是引起酸奶后酸化的主要菌种。为了筛选保加利亚乳杆菌后酸化相关功能基因表达分析的qRT-PCR内参基因,以保加利亚乳杆菌的模式菌株ATCC 11842为试验菌株,根据前期ATCC11842菌株在后酸化不同条件下转录组学测序结果,选择5个候选内参基因（16SrRNA、rpoB、ldh、rodA、recA）,通过qRT-PCR技术研究候选内参基因在酸胁迫和酸冷胁迫下的表达量水平,即Ct值变化。采用3款软件geNorm、NormFinder和Bestkeeper分析比较候选内参基因在酸胁迫和酸冷胁迫下qRT-PCR的表达稳定性,并筛选获得qRT-PCR的最适内参基因。运用筛选到的最适内参基因,分析ATCC 11842菌株的3个目的基因（poxI、Ldb1301、dnaJ）在酸胁迫和酸冷胁迫下qRT-PCR的相对表达量,验证筛选的内参基因的可靠性。结果表明：同一候选内参基因Ct值在酸胁迫和酸冷胁迫下,rpoB和recA表达量变化最小。比较3个软件分析结果,一致得出：rpoB和recA是在酸胁迫和酸冷胁迫下表达最稳定的2个基因,即筛选出的qRT-PCR最适内参基因为rpoB和recA;3个目的基因（poxI、Ldb1301、dnaJ）在酸胁迫和酸冷胁迫下qRT-PCR的相对表达量的分析结果与前期转录组学测序结果一致,进一步证实本研究筛选的2个内参基因rpoB和recA的可靠性。本文为利用qRT-PCR技术研究保加利亚乳杆菌后酸化功能基因表达以及揭示后酸化机制及定向选育弱后酸化菌株提供了依据;也为采用qRT-PCR技术研究其它益生乳酸菌引起酸奶后酸化或不同条件下功能基因表达提供借鉴。     

外源AHLs培养下荧光假单胞菌qPCR内参基因的筛选

目的：荧光假单胞菌是冷藏食品的优势腐败菌,其致腐基因受到群体感应系统的调控。为了准确定量腐败基因的表达,研究群体感应调控食品腐败的机制,需筛选荧光假单胞菌的内参基因。方法：以荧光假单胞菌PF-08为研究对象,选择8个常见的内参基因（dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16S rRNA）,添加不同类型群体感应信号分子培养后,利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测其基因表达量,采用geNorm、Normfinder、BestKeeper和RefFinder综合评估候选内参基因的表达稳定性,筛选最适内参基因。结果：在不同类型外源信号分子培养下,荧光假单胞菌中Ct值变化程度最小的是gltA,16S rRNA的Ct值过低;geNorm分析表达最稳定的内参基因是atpD和rpoD,且二者联用能准确定量目的基因表达水平;Normfinder和BestKeeper的分析结果都显示gltA是最稳定的内参基因;进一步用RefFinder综合评估,内参基因中表达较稳定的是rpoD和gltA。结论：rpoD和gltA在荧光假单胞菌经不同QS信号分子处理后均稳定表达,可用于...     

烟草谷胱甘肽转移酶基因NtGSTU17的鉴定及表达特性分析

为研究烟草谷胱甘肽转移酶(GSTs)的功能,采用同源搜索的方法从NCBI数据库中找到1个烟草GSTs类似基因,通过聚类分析、体外活性分析对该基因及其表达产物进行鉴定;打顶和农药(代森锰锌、百草枯)处理烟草后,运用荧光实时定量PCR技术对该基因的表达特性进行分析。结果表明:该基因是tau类GST基因,命名为Nt GSTU17,其编码区长666 bp,编码221个氨基酸;该基因编码产物对谷胱甘肽转移酶通用底物1-氯-2,4-二硝基苯(1-Chloro-2,4-dinitrobenzene,CDNB)具有较高的偶联活性;Nt GSTU17基因在烟草中为组成型表达,但在根中的表达量要低于地上部分的表达量;打顶对该基因的表达有一定上调效应;代森锰锌处理烟草后在短期内能快速、显著上调Nt GSTU17基因的表达,而百草枯处理烟草后则能显著抑制根中Nt GSTU17的表达,表明Nt GSTU17基因可能参与烟草的胁迫应答反应,并对不同农药的胁迫表现出选择性。     

烟草Nt14-3-3基因的克隆及生物信息学和表达模式分析

为明确烟草中Nt14-3-3基因家族的功能,采用同源克隆的方法,在烟草品种K326中克隆到1个14-3-3蛋白基因Nt14-3-3,并进行了生物信息学分析。运用qRT-PCR技术,对该基因非生物胁迫处理烟草幼苗后的表达特性进行了分析。结果显示,该基因序列全长783 bp,编码260个氨基酸残基。Nt14-3-3蛋白是由9个α螺旋组成的球状蛋白,含有32个磷酸化位点。组织表达分析发现,该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,在根中的表达量最高。Nt14-3-3基因受低钾、高盐、干旱、脱落酸(ABA)、H_2O_2处理的诱导,表明烟草Nt14-3-3基因参与了烟草的非生物胁迫应答反应。     

烟叶衰老过程中类胡萝卜素代谢及相关基因表达分析

成熟叶片中类胡萝卜素含量与烟叶品质密切相关。为探究烟草叶片衰老过程中类胡萝卜素组分变化及代谢相关基因表达情况,本研究以普通烟草红花大金元为材料,采用液相色谱法测定不同发育时期烟叶中新黄质、叶黄质和β-胡萝卜素的含量;通过转录组数据分析结合实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法,分析烟草叶片衰老成熟过程中类胡萝卜素代谢相关基因的表达变化。结果显示,烟草进入成熟衰老期叶片中新黄质、叶黄质、β-胡萝卜素含量逐渐降低;类胡萝卜素合成基因GGPS、PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LYCB和LYCE呈现下调表达,类胡萝卜素降解基因LOX、POD和CCD1呈现上调表达,PAL和PPO呈现下调表达。类胡萝卜素转化基因ZEP、NXS、NCED呈上调表达。类胡萝卜素合成相关转录因子基因ORANGE、HY5、COP1、DET1呈现下调表达,而MYB5b、Cry-2呈现上调表达。随着烟叶成熟衰老,类胡萝卜素合成减弱,而降解增强。研究结果为烟叶成熟衰老过程中类胡萝卜素代谢的分子调控及针对类胡萝卜素含量定向改良烟草品种奠定了基础。     

雪茄烟叶（BESNO H382）不同组织器官及盐胁迫条件下内参基因的筛选

为了筛选适用于雪茄烟叶（BESNO H382）基因定量研究的内参基因,以温室栽培条件下雪茄烟叶的不同组织器官（旺长期根、茎、叶,盛花期花萼、花冠、柱头、子房、雄蕊、雌蕊及种子）及不同盐处理条件下（300 mmol/L NaCl处理不同时间）的样品为材料,采用实时荧光定量PCR技术对从雪茄烟叶转录组数据中筛选到的10个候选内参基因进行分析,同时使用geNorm、NormFinder和BestKeeper等3种软件综合评价这些候选基因的表达稳定性。结果表明,RPL14A和UBC27最适合作为雪茄烟叶不同组织的内参基因;UBC28最适合作为雪茄烟叶不同盐处理条件下的内参基因。分别以UBC27、UBC28和RPL14A为内参基因考察了胁迫相关基因脯氨酸合成酶基因（P5CS）在盐胁迫下的表达情况,发现P5CS上调表达且相对3个内参基因的表达量和变化趋势均较为一致。      

过表达TaGS1/TaGS2对烟草氮素吸收的影响

  目的  为揭示小麦氮素同化关键酶谷氨酰胺合成酶（TaGS1/TaGS2）在烟草中过表达对烟草氮素吸收同化能力的影响及其机制。  方法  以烟草栽培品种K326为对照,测定分析过表达TaGS1/TaGS2烟草的生长及氮代谢指标;利用转录组结合进化树分析,确定烟草硝酸转运蛋白家族（NtNRT/NPF）及其表达水平。  结果  过表达TaGS1/TaGS2烟草根系发达、叶片变大,氮素吸收同化积累显著升高;在烟草中鉴定到36个NtNRT/NPF家族基因;过表达TaGS1/TaGS2引起其中28个NtNRT/NPF家族基因表达变化,与qRT-PCR结果一致。  结论  过表达TaGS1/TaGS2可能通过提高NtNPF6.3、NtNRT3.1、NtNPF7.3等NtNRT/NPF家族基因表达,促进烟草氮素吸收、同化与积累,为烟草生长发育提供充足氮源。      

烟草NtbHLH112基因的克隆、鉴定及表达模式分析

bHLH转录因子在植物响应逆境胁迫过程中起着极为重要的调控作用,克隆和验证烟草中bHLH相关基因可为烟草抗性育种提供理论依据。本研究从普通烟草品种K326中克隆出一个NtbHLH112基因,通过生物信息学方法分析了NtbHLH112功能结构域,利用亚细胞定位及转录激活试验进行了功能鉴定,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析了其在不同逆境胁迫下的表达模式。结果表明,NtbHLH112具有典型的bHLH结构域且进化较为保守,定位在细胞核,具有转录激活的活性。进化分析表明,NtbHLH112与番茄SlbHLH112和辣椒CabHLH112同源。表达模式分析表明,NtbHLH112基因具有组织表达特异性,在叶部表达量较高,并且受到盐、干旱、冷胁迫及ABA处理诱导。因此,NtbHLH112转录因子可能在烟草非生物胁迫应答过程中发挥重要作用。     

烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析

为揭示烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的功能,采用同源克隆的方法从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆了NtZDS基因,并进行了遗传进化分析。同时通过荧光定量PCR技术分析NtZDS的时空表达模式、利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草中ZDS基因的表达,在该基因沉默后再通过定量PCR技术分析NtZDS上下游基因的表达量变化,并检测了烟株色素含量的变化。结果显示:NtZDS基因在普通烟草中至少存在两个同源拷贝,其编码序列与番茄、马铃薯的ZDS基因相似度高于90%。NtZDS在烟草盛花期的叶和花中表达量最高。与对照比较,该基因沉默后,烟株新生叶片出现严重白化现象,能够为VIGS体系提供一个良好的候选报告基因;同时类胡萝卜素合成通路其他基因的表达量和烟株类胡萝卜素、叶绿素含量都显著降低,表明ZDS基因在烟草生长发育及类胡萝卜素合成过程中发挥着重要作用。      

普通烟草KCS基因家族的鉴定及非生物胁迫表达模式分析

【目的】为探究烟草KCS基因在非生物胁迫下所起的作用。【方法】采用生物信息学方法对烟草KCS基因进行系统进化、共线性和表达模式等分析。【结果】从普通烟草中鉴定出41个KCS基因;拟南芥和新鉴定的烟草KCS基因可划分为8个亚组,大部分亚组均含拟南芥和烟草成员;10个NtKCS成员源自全基因组复制事件,NtKCS10和NtKCS11是AtKCS02的同源基因,可能具有相似的生物学功能;普通烟草KCS基因启动子含多个与胁迫相关的顺式作用元件,其成员的表达具有一定的组织特异性;在盐和干旱胁迫下,NtKCS09、NtKCS11和NtKCS16表达量均有提高,可能参与烟草胁迫响应等信号传导过程。【结论】本研究对普通烟草KCS家族成员进行了系统的鉴定与分析,为深入研究烟草KCS家族基因的生物学功能奠定理论基础。     

低氮胁迫诱导烟草亲环素基因表达的研究

为研究低氮营养对烟草生长的主要影响,分别在移栽后50d到70d期间测量了低氮胁迫和正常营养条件下烟株中部叶片的叶宽、叶长和50d与60d时的株高,同时应用实时荧光定量PCR方法分析了移栽后50d到70d期间烟草叶片中胁迫响应基因亲环素mRNA的表达量.结果发现低氮营养下叶长、叶宽和株高都小于正常营养条件下的叶片,但是叶长、叶宽平均生长增幅显著大于正常营养下的叶片,而株高的增长幅度则没有明显差异.低氮胁迫下叶片亲环素基因mRNA表达量与正常条件下的基因转录表达量相比有显著增加,最高为正常条件下的6.9倍,并且在移栽后50d到70d期间相对转录水平呈递增趋势.水培实验也证明低氮胁迫可显著诱导叶片亲环索基因的转录表达,诱导表达量达2.0倍之多.结果表明低氮营养胁迫对烟草叶片的生长影响较为显著,且低氮营养可以诱导烟草叶片亲环素基因mRNA表达大量增加,推测低氮营养胁迫下亲环索基因的大量诱导表达可能参与了对烟草叶片生长的调节过程.     

烟草Hsp70基因家族的鉴定及NtHsp70Chl基因的表达分析

为探明烟草热激蛋白70（Hsp70）基因家族的特征及烟叶主脉中NtHsp70Chl基因在烘烤条件下的表达模式,对Hsp70基因家族进行了亚细胞定位、系统进化、基因结构、染色体定位,并对NtHsp70Chl基因进行了烘烤条件下实时荧光定量表达PCR分析。结果表明,烟草基因组中Hsp70基因家族共有61个成员,蛋白序列长度不等,等电点在4.52~9.75范围内,各成员蛋白分别定位于细胞质、内质网、细胞外基质、叶绿体和线粒体中;烟草Hsp70基因家族分为6组,定位于叶绿体的成员均存在Ⅵ-a亚组;61个NtHsp70基因分布于18条染色体上,经亚细胞定位于叶绿体的基因分别位于6、17和19号染色体上;烟草Hsp70家族中具有10个基因重复和5个旁系同源基因;经RT-qPCR检测分析,定位于烟草叶绿体中的NtHsp70Chl基因对高温诱导的敏感性较弱。本研究为深入研究烟草Hsp70的功能奠定了基础。     

烟草PPO基因家族鉴定与不同成熟度烟叶烘烤过程中PPO活性分析

【背景与目的】多酚氧化酶（PPO）参与的棕色化反应是生产高品质烟草产品的关键环节，为了明确烟草中PPO基因的结构与功能。【方法】通过生物信息学的方法鉴定烟草PPO基因家族成员及其特征；利用qRT-PCR方法分析了翠碧一号上部4种成熟度烟叶（M1～M4）PPO基因的表达，并采用多酚氧化酶活性检测试剂盒测定烘烤过程中烟叶PPO酶活性变化。【结果】烟草基因组中共鉴定到12个NtPPO基因，大多数成员具有类似的基因结构、相近的蛋白长度和保守的蛋白结构域。系统进化分析将菠萝、高粱、番茄、马铃薯和烟草的PPO蛋白分为3个亚族，其中Ⅱ，Ⅲ亚族中均为双子叶植物的PPO成员。NtPPOs基因家族成员的表达量随着成熟度提高表现出不同的变化模式，大多数成员在过熟烟叶中表达量最低。烘烤过程中不同成熟度烟叶中PPO活性也存在明显差异，其中M2、M3和M4成熟期烟叶PPO活性呈现先下降后上升再下降的趋势，在45℃达到最大值，且M2>M3>M4。【结论】研究结果可为烟草PPO基因的功能研究、烟叶棕色化的调控和品种遗传改良奠定基础。     

烟叶落黄过程中烟碱代谢规律及相关基因表达分析

为探究烟草叶片落黄衰老过程中生物碱组分变化及代谢相关基因表达情况,以红花大金元为材料,气相色谱-质谱联用法测定中部烟叶生物碱含量,利用已有的烟草叶片衰老转录组数据(RNA-seq),分析叶片衰老成熟期烟碱代谢相关基因的表达水平,同时实时荧光定量PCR验证基因表达。结果显示,烟草进入成熟衰老期,叶片中烟碱、去甲基烟碱、新烟草碱、麦斯明等生物碱含量逐渐升高,烟碱转运蛋白基因JAT1、NUP1,烟碱转化基因CYP82E2、CYP82E4,烟碱合成基因ADC1、ODC2、BBL2以及烟碱代谢调控基因COI1、JAZ1、MYC2、MYC3呈现上调表达,而调控基因MTHFR1下调表达。差异表达基因协同调控烟碱代谢过程,影响衰老叶片中的烟碱合成与积累。     

烟草TPP基因家族鉴定及表达模式分析

海藻糖-6-磷酸磷酸酶（TPP）是植物海藻糖代谢过程的关键酶,在植物的生长发育及非生物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。为挖掘参与烟草发育及抗逆胁迫的TPP基因家族成员,本研究通过生物信息学的方法,在普通烟草基因组中共鉴定出了15个TPP基因,其中7个TPP基因定位在染色体上。系统进化分析发现,新鉴定的烟草TPP成员可分为3个亚家族,分别为CLASS Ⅰ、CLASS Ⅱ和CLASS Ⅲ。共线性分析表明,有5个烟草Nt TPP基因分别与7个拟南芥AtTPP基因形成同源基因对。启动子分析发现,NtTPP成员的启动子上存在多种激素和非生物胁迫响应元件。表达模式分析发现,NtTPP基因表达具有一定的组织特异性,大部分NtTPP基因在根中的表达量最高,有12个NtTPP基因在干旱胁迫下表达量上调,13个NtTPP基因能够被盐胁迫显著诱导表达。这说明NtTPP基因家族成员在烟草非生物胁迫应答中发挥着重要作用。     

TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能

NAC (NAM-ATAF-CUC)转录因子在植物逆境胁迫应答反应中发挥重要作用。通过同源克隆的方法从小麦中分离得到一个编码NAC转录因子的基因--TaNAC,该基因编码的蛋白序列结构特殊,N端为保守性差的NAC保守域,只包含A,B,D三个亚结构域,进化关系上与DREB家族更近,其C端共同享有多个基序。实时荧光定量PCR实验证实TaNAC基因受干旱诱导24 h后强烈表达。将该基因构建到PBI121双元植物表达载体的35S启动子下游,通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草,获得T1代转基因苗。模拟干旱胁迫处理实验表明,过量表达TaNAC的转基因烟草表现出明显优于野生型对照的抗旱功能,说明TaNAC基因的过量表达能够提高烟草抗旱能力,TaNAC可以作为烟草抗旱育种的优良候选基因资源。      

普通烟草SWEET基因家族的鉴定与表达分析

  目的  为挖掘参与烟草糖代谢的SWEET（sugar will eventually be exported transported）基因家族成员。  方法  以拟南芥SWEET蛋白为参考,利用生物信息学方法,对栽培烟草的SWEET蛋白家族进行鉴定,分析蛋白理化性质、系统进化、染色体定位、基因结构和顺式作用元件,对其在不同组织和不同胁迫处理的表达模式进行检测。  结果  从普通烟草中鉴定到70个可能的SWEET基因,系统发育树将其划分为4个亚家族,大多数烟草SWEET基因在进化过程中经历纯化选择。不同烟草组织的表达模式分析显示,一些烟草SWEET基因具有组织表达特异性。不同胁迫处理的表达模式分析显示,部分烟草SWEET基因在葡萄糖、蔗糖、低温、干旱或者是盐胁迫处理下表达量变化明显。  结论  Ntab0097340和Ntab0727890是烟草植株重要的响应干旱与低温胁迫的基因,本研究为深入研究烟草SWEET基因功能提供有价值的参考信息。      

烟草SOC1基因的克隆和表达分析

SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANTS 1（SOC1）基因属MADS-box转录因子家族,在植物成花诱导过程中起关键作用,但在营养生长过程中的调控功能还未获得充分研究。为明确SOC1基因在叶片中的生理作用,克隆到烟草中SOC1基因的完整开放阅读框,全长806bp。农杆菌介导转化烟草后,获得26棵转基因植株,其中23棵鉴定为阳性植株,转化率为88.46%。与野生型烟草K326相比,获得的SOC1过表达烟株开花提前,株高增加,叶片宽大。半定量RT-PCR结果显示,SOC1过表达不影响叶片中Rubisco大亚基、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶基因的表达水平,但提高了抗坏血酸氧化酶的表达水平;提高了碳酸酐酶活性、蔗糖含量和还原性抗坏血酸含量,并降低了抗坏血酸过氧化物酶活性。表明SOC1可能通过影响叶片抗坏血酸库的氧化还原状态而提高碳酸酐酶活性和光合速率。      

烟草叶片在二氯喹啉酸胁迫下的蛋白组学分析

为明确二氯喹啉酸对烟草药害的机理,采用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术分析了二氯喹啉酸处理7 d后烟草畸形叶片较正常叶片的蛋白组学变化。本研究共鉴定出65个差异蛋白,其中表达量上调的23个,下调的42个,它们具有结合、催化和转运等分子功能。分别参与光合作用、防御/抗胁迫、代谢等细胞过程,荧光定量PCR验证结果与蛋白组学数据一致。ABA合成通路中的ABA2及NCED基因能够响应二氯喹啉酸胁迫信号,分别在处理后48和24 h达到表达高峰,处理后72 h下调至较低水平。根据这种上调表达后又迅速下调的基因表达模式,推测烟草体内存在一种应激机制抵抗二氯喹啉酸胁迫。本研究首次在烟草中采用蛋白组学的方法分析二氯喹啉酸胁迫下基因的表达变化,并获得重要候选基因。     

普通烟草NtIAA13b基因的克隆及功能分析

为探究生长素诱导相关基因NtIAA13在烟草钾吸收与利用中的作用,以烟草K326的cDNA为模板,克隆了一个全长879 bp,编码292个氨基酸的基因,并将该基因命名为NtIAA13b。采用qRT-PCR和亚细胞定位等生物技术对NtIAA13b基因在不同组织和不同非生物胁迫条件下的表达特性进行分析,通过转基因技术获得NtIAA13b基因过量表达株系并验证其生理功能。结果表明,NtIAA13b基因所编码的蛋白质相对分子质量为31.71 kD,理论等电点（pI）为6.48。NtIAA13b基因的启动子区包含生长素响应元件TGA-element、赤霉素响应元件P-box和参与厌氧诱导的调控元件ARE等。亚细胞定位的结果显示,该蛋白定位于细胞核。系统进化树结果表明,NtIAA13b和番茄SlIAA13亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,NtIAA13b基因在根中的表达水平最高,其次为茎,叶中表达水平最低。在正常供钾条件下,过量表达株系叶片的钾含量极显著增加。NtIAA13b基因与烟草响应低钾胁迫有关,可能参与了烟草钾的吸收与利用。