栉孔扇贝酸性α-醋酸萘酯酶的组织化学研究

采用酶组织化学方法对栉孔扇贝(Chlamys farreri)各主要器官组织中的酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)进行了定性定位研究。结果表明，栉孔扇贝的大部分器官，包括：外套膜、鳃、唇瓣、口唇、胃、肠、直肠、肝脏、肾脏、生殖腺、心脏和闭壳肌，其上皮组织和大血窦多呈很强的ANAE阳性( )；血细胞呈ANAE强阳性( )；结缔组织和肌纤维呈ANAE较强阳性( )或弱阳性( )；肝脏肝小叶呈较强的ANAE阳性；肾脏肾小管呈ANAE强阳性。生殖腺滤泡呈很强的ANAE阳性。     

栉孔扇贝外套膜酸性和碱性磷酸酶电镜细胞化学研究

采用电镜细胞化学技术对栉孔贝（Chlamys farreri）外套膜中的酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）进行了定性定位研究。结果表明，外套膜的所有上皮细胞和结缔组织中部分务细胞呈ACP强阳性。上皮细胞中高电子密度阳性颗粒多为圆形，直径300－450mm；内多也呈ACP强阳性；微绒毛等呈弱阳性。血细胞中次级溶酶体内有数目和大小不同的ACP强阳性颗粒；内质网等内膜系统呈ACP弱阳性。外套膜的所有上皮细胞和血细胞均呈AKP强阳性。AKP阳性颗粒常沿着细胞膜分布；内质网等内膜系统呈AKP强阳性；上皮细胞中一种近圆形直径约250－420nm的颗粒也呈AKP强阳性。     

温度刺激下栉孔扇贝不同组织热休克蛋白HSP70的表达研究

采用免疫印迹(Western blot)和流式细胞术(flow cytometry,FCM)方法,研究了热激栉孔扇贝不同组织内热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)的表达变化。免疫印迹结果显示,HSP70的诱导表达有组织特异性,即热休克可以使扇贝鳃组织中HSP70的表达明显升高,但在肌柱、外套膜和性腺组织中,未检测到HSP70的表达。流式细胞术结果表明：在不同的季节,相同的热刺激对扇贝血淋巴中HSP70的诱导表达存在差异。高温刺激后,栉孔扇贝血淋巴细胞中HSP70的表达量逐渐升高,在诱导7h时达到最高。     

CpG序列和猪白细胞介素-6基因转染表达对猪囊尾蚴基因疫苗免疫影响的研究

以猪囊尾蚴VTS76抗原基因和质粒VPIL-6、pUC18-CpG免疫接种小鼠，检测了小鼠的体液及细胞免疫反应，结果发现，VPIL-6或pUC-CpG与VTS76共同免疫小鼠的特异性抗体滴度，IgG含量，淋巴细胞白细胞介素-2诱生活性、脾细胞增殖反应和血液免疫细胞数量显著高于VTS76免疫组和对照组，证明VPIL-6和CpG序列能显著增强动物对DNA疫苗的细胞和体液免疫反应，可作为高效的基因免疫增强剂。     

表达人白细胞介素—2的重组腺病毒的制备

携带人白细胞介素－２ ｃＤＡ序列的Ｅ１区缺陷的腺病毒载体ｐＡｄｌ２／ＲＳＶ－ＩＬ２－ｂｐＡ与ｐＪＭ１７质粒，通过磷酸钙沉地共转染２９３细胞，经同源重组，获得了一个腺病毒噬斑。抽提腺病毒ＤＮＡ，运用ＰＣＲ扩增及ＸｂａＩ酶切检测，证实这一噬斑为带有人ＩＬ－２ ｃＤＮＡ序列的重组腺病毒。受其感染的２９３细胞和人黑素瘤Ａ３７５细胞上清中，都能够测出ＩＬ－２的活性，表明制备的重组腺病毒是能表达人ＩＬ－２的。     

白细胞介素8基因-251A/T多态与子宫内膜异位症的相关性研究

目的:探讨白细胞介素8基因(IL-8)-251A/T多态性在子宫内膜异位症发生中的作用.方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和焦磷酸测序方法,研究152例子宫内膜异位症患者和134例正常子宫内膜中IL-8基因-251A/T多态性的分布情况.结果:IL-8基因-251A/T多态位点的AA、AT和TT基因型在子宫内膜异位症组中分别为12.5％、46.1％、41.5％,等位基因A和T的频率分别为35.5％、64.5％;在对照组中AA、AT和TT三种基因型分布频率分别为24.6％、41.0％、34.3％,等位基因A和T的频率分别为45.1％、54.9％.IL-8基因-251A/T单核苷酸多态是子宫内膜异位症发病的独立的危险因素(P＜0.05);A等位基因携带者患子宫内膜异位症的风险增高(P＜0.05).结论:在中国北方汉族人群中IL-8基因-251A/T单核苷酸多态性与子宫内膜异位症的发病具有相关性,A等位基因是子宫内膜异位症发病重要的遗传学标记.     

猪、牛成纤维细胞α-1,3-半乳糖基转移酶基因的敲除以及人白细胞抗原-G1基因的敲入

构建了敲除猪α-1,3-GT并敲入人白细胞抗原HLA-G1基因的打靶载体pZJ,其中以新霉素抗性基因(Neo)为正筛选基因,绿色荧光蛋白基因(GFP)为负筛选基因.采用优化的脂质体转染法将打靶载体pZJ转染于一个长势良好的胎猪成纤维细胞系中,经7天G418(600 μg/ml)药物筛选,共获得30个Neo抗性细胞克隆,其中12个为非绿色荧光细胞克隆,7个扩大培养良好,提取阳性克隆细胞的基因组DNA并进行PCR检测.经PCR结果检测,打靶载体转入到胎猪成纤维细胞中,其中3个非荧光阳性单克隆细胞在细胞基因组中进行了定点整合.以同样的脂质体转染条件将pZJ转染牛胎儿成纤维细胞,经筛选并对其进行PCR检测,其中2个均为定点整合阳性.该研究为今后克隆出表达HLA-G1而不表达α-1,3-GT基因的个体猪,从而提供可以真正用于临床的异种器官打下了基础,也为猪牛之间的跨物种敲除提供了一个佐证.     

共表达H5、H7亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5和H7亚型禽流感病毒血凝素(AIV HA)基因串联后(拥有同一个阅读框)和鸡白细胞介素-18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子1(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡白细胞介素-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-H7-IL18;用相同的方法构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-IL18;将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游,构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行三次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因、H7亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出H5HA-H7HA融合蛋白基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-H7HA-IL18,H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18以及单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA.这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.     

双重改性聚偏氟乙烯膜的制备及血液相容性

以聚偏氟乙烯(PVDF)为基体,以亲水性、生物相容性极佳的丙烯酰吗啉(ACMO)及带强阴离子性磺酸基的2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)为功能单体,通过自由基聚合制得PVDF接枝共聚物,并用红外光谱和核磁共振对其进行表征。通过浸没沉淀相转化法制备了共聚物膜,用X射线光电子能谱仪、扫描电子显微镜、接触角测试仪、全自动凝血仪对膜的表面组成、结构形貌、亲水性及血液相容性进行了研究。结果表明,在成膜过程中功能基团均向膜表面偏析,有致孔作用。与纯PVDF膜相比,改性膜的亲水性提高,且能抑制血细胞粘附,其活化部分凝血活酶时间及凝血酶原时间分别延长了7.80 s和2.83 s,纤维蛋白原的浓度从0.897 g/L降低到0.818 g/L,改性后膜的亲水性及血液相容性提高。     

重组治疗性乙型肝炎疫苗（YIC）的实验研究

研制了抗原-抗体复合物型乙肝治疗性疫苗。用小鼠实验证明这一治疗性疫苗的作用机理为：通过复合物中抗体Fc段与抗原呈递细胞表面的Fc受体结合,促进了细胞摄取抗原。复合物中的抗原经呈递后可比单纯抗原更有效地激活T细胞增殖,释放更多的γ-干扰素和白细胞介素-2,属TH1类型应答。复合物可在小鼠中诱生较单纯抗原诱生的抗-HBs高10倍以上。复合物还可诱生更强的细胞免疫,表现为经特异的抗原刺激后,γ-干扰素的mRNA量增多。还发现复合物可在对HBsAg低应答鼠系中（B 10.S）诱生与正常应答鼠相当的抗体效价。在HBsAg阳性转基因鼠中,复合物可使部分鼠的HBsAg转为阴性,并可产生抗-HBs,反映这一疫苗具有疗效。为制备人用乙肝治疗性疫苗建立了用重组酵母菌表达的HBsAg与人高效价抗乙肝免疫球蛋白组建治疗性疫苗的工艺,以及产品标化及效力的参比实验技术。     

栉孔扇贝血细胞的吞噬作用及其扫描电镜研究

用透射电镜和扫描电镜技术对栉孔扇贝血细胞的吞噬作用和表面结构进行了研究,结果表明,栉孔扇贝血细胞对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有很强的吞噬能力,注射细菌15h后,吞噬率分别达25％和27％,小颗粒（嗜中性颗粒）细胞吞噬能力最强,中颗粒（嗜碱性颗粒）细胞吞噬能力较弱,大颗粒（嗜酸性颗粒）细胞无吞噬能力,无颗粒细胞中只有少量较大的细胞具有吞噬能力。吞噬体不断与小空泡（初级溶酶体）融和形成大的吞噬体,并在其内将细菌逐步消化降解,吞噬体中的细菌也可被分散包围成多个小吞噬体后分别被降解。扫描电镜观察栉孔扇贝血细胞的圆形、椭圆形和梭形三种形状,多数血细胞容量变形形成伪足,可形成大量长的纤维状伪足的血细胞具有凝血的功能。     

免疫多糖对栉孔扇贝血淋巴中氧化酶活力的影响

于栉孔扇贝体中分别注射酵母聚糖和硒多糖两种免疫多糖后,分别测定了栉孔扇贝血清和血细胞中两种参与免疫防御的酚氧化酶（PO）和髓过氧物酶（MPO）的活力。结果表明,注射酵母聚糖后,血清中PO活力仅在1h时实验组极显著地高于对照组,而血细胞中无PO活力,注射硒多糖后,血清中PO活力在1和15h时时显著高于对照组,而血细胞中未检测到PO活力：血清中MPO活力在1、15和30h时,血细胞中MPO活力在1和15h时实验组显著高于对照组,说明酵母聚糖和硒多糖两种免疫多糖对栉孔扇贝血淋巴中PO和MPO的活力均有增强作用。     

Continuous release of interleukin-2 from liposomal IL-2 (mixture of interleukin-2 and liposomes) after subcutaneous administration to mice

Recombinant interleukin-2 (IL-2) was strongly and almost completely adsorbed onto small and hydrophobic liposomes by simple mixing under optimal conditions (liposome: DSPC-DSPG; molar ratio, 10:1; 30-50 nm in size, ratio of IL-2 to liposome: 4.0 JRU/nmol lipid). This liposomal IL-2 displayed better distribution after intravenous administration in mice and improved therapeutic effect against experimental M5076 metastases, as reported previously.[1] In this study, the elimination of IL-2 from the dosing area was investigated when the liposomal IL-2 was administered to mice subcutaneously. The results suggest that the release of IL-2 from this liposome was continuous and almost complete. The mean residence time (MRT) of IL-2 in the dosing area was 11.0 ± 1.65 hr. This resulted in the 8-fold times enhancement of MRT in the systemic circulation by the presence of liposomes, and IL-2 was detected in the serum for 2 days. Using this liposomal IL-2 is expected to have the potential to decrease the number of injections and enhance the efficacy of IL-2 in immunotherapies and therapies against tumor.     

栉孔扇贝C型凝集素基因的克隆与表达研究

C型凝集素作为凝集素家族中的主要成员之一,在识别外来微生物表面碳水化合物基团和激活体液中免疫因子等方面具有重要作用。本研究在EST分析的基础上采用锚定PCR方法克隆得到了该基因的全长cDNA。克隆得到的栉孔扇贝C型凝集素cDNA全长1038bp,编码区684bp,可以编码228个氨基酸。在该编码的氨基酸序列中发现了C型凝集素家族的特征模体和一个C型凝集素的结构域(C-type leetin domain,CTLD)。通过Clustalw和SMART分析在该序列中发现了形成二硫键的4个保守的半胱氨酸,与其他物种C型凝集素的二硫键结构非常相似。结合BLAST分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝C型凝集素的编码序列。用RT-PCR技术在鳗弧菌感染前后的血细胞中均可以检测到该基因的表达,但病原刺激前的表达水平相对较低,病原刺激后4h起表达开始升高,并在6h达到最高,随后逐渐开始下降,并于32h恢复到原来水平,该结果表明C型凝集素存在组成型和诱导型两种调控机制,在扇贝防御病原感染的过程中发挥重要作用。     

扇贝多肽(PCF)抑制紫外线诱导的HaCaT细胞凋亡

建立了紫外线A和B辐射诱导的永生化角质形成细胞(HaCaT)凋亡的模型,采用四甲基偶氮唑盐法、琼脂糖凝胶电泳、流氏细胞仪、酶化学方法和蛋白印迹等技术,研究了扇贝多肽(PCF)抑制紫外线诱导HaCaT细胞凋亡的分子机制。实验发现,PCF可明显抑制紫外线A和B诱导的HaCaT细胞凋亡。1.42~5.68mM剂量范围内PCF剂量依赖性抑制紫外线诱导的HaCaT细胞内活性氧的生成,并能提高细胞内抗氧化酶活性,增强细胞总抗氧化能力,减少脂质过氧化产物的产生;同时,PCF也抑制细胞内JNK蛋白的磷酸化及Caspases-3蛋白的活化。通过加入ROS、JNK和Caspase-3抑制剂证实,PCF作为抗氧化剂减少了细胞内ROS的生成并提高了细胞内抗氧化酶活性,进而阻断了ROS→JNK→Cas-pase-3信号级联反应,抑制了紫外线辐射诱导的HaCaT细胞凋亡。     

Quantification of recombinant interleukin-2 in human serum by a specific immunobioassay

A sensitive and specific assay for recombinant interleukin-2 (rIL-2) in human serum is described. The assay is based on a sequential sandwich immunobioassay that uses a microtiter plate coated with anti-rIL-2 monoclonal antibody (specific for recombinant human IL-2) to capture rIL-2 from serum, and an IL-2 dependent T-cell line that proliferates in a dose-dependent fashion. The lower limit of quantitation of the assay is 2 units/mL (1 unit = approximately 50 pg) using 0.1 mL of serum and the calibration curves ranged from 2 to 50 units/mL. Data are reported on the sensitivity, precision, reproducibility, and specificity of the assay; the stability of rIL-2 in serum; and the recovery of rIL-2 from serum. We also report on the use of the procedure to assay clinical samples from patients with AIDS undergoing treatment with rIL-2.     

新型Sb2S3-Sb2Se3与单晶二氧化钛纳米阵列复合结构在太阳能电池领域的应用

近年来,半导体量子点敏化太阳能电池作为新一代的太阳能电池,引起了广泛的关注．Sb2S2和Sb2Se3量子点由于具有出色的光吸收特性与带隙的可调控性,已成为敏化太阳能电池领域的重要组成部分．通过水热法,二氧化钛（TiO2）单晶纳米阵列被成功生长在FTO导电玻璃上．通过连续离子层吸附法（SILAR）,Sb2S3Sb2Se3复合纳米结构被生长在二氧化钛单晶纳米阵列的表面．利用x射线衍射（XRD）表征Sb2S3和Sb2Se3纳米晶体的晶相,利用扫描电子显微镜（SEM）表征其形貌,发现在这一复合结构中,二氧化钛单晶纳米阵列与Sb2S3结合之后所留下的空隙被Sb2Se3量子点填充,从而提高了结构表面积的利用率．随着连续离子层吸附法反应周期的增加,Sb2S3-Sb2Se3,与二氧化钛单晶纳米阵列共同形成复合结构的带隙发生了明显的红移,吸收边在可调控的情况下由1．7eV向红外波段发生了移动．这种纳米结构的比表面积大、工艺简单、结构致密、沉积速率快、可调控性强,对于今后敏化太阳能电池领域的应用有很大的启发作用．     

脂质体包裹猪白细胞介素6基因对猪带绦虫抗原基因免疫小鼠的影响

比较研究了BALb/c小鼠分别肌肉注射猪带绦虫抗原基因VTS76、猪白细胞介素6（VPIL－6）联合VTS76及其阳离子脂质体包裹质粒等5个处理的免疫效应。结果表明，VTS76联合VPIL－6共注射小鼠的IgG含量和抗体滴度，脾细胞增殖反应和IL－2诱生活性以及免疫细胞数量，均比注射VTS76的显著增强。经阳离子脂质体包裹的VTS76＋VPIL－6在减少质粒用量80％时，免疫应答水平仍显著高于脂质体包裹VTS76，且明显高于VTS76＋VPIL－6，证明VPIL－6能显著增强基因疫苗（VTS76）免疫小鼠的免疫应答。     

Mannose functionalized plain and endosomolytic nanocomposite(s)-based approach for the induction of effective antitumor immune response in C57BL/6 mice melanoma model

The goal of present study to assess the antigen specific immunopotentiation effect of mannose functionalized endosomolytic and conventional nanocomposite(s) based combination approach using C57BL/6 mice melanoma model. Endosomolytic and conventional nanocomposite(s) were prepared by double emulsification method. The optimized formulation was extensively characterized for average particle size, zeta potential and PDI of nanocomposite(s) which were measured in range of ≈200?nm, 0.111?±?0.024, –23.4?±?2.0?mV, respectively. pH-dependent morphological changes in the surface of MRPRPNs and PRPNs were analyzed by using surface electron microscopy at different time intervals. The cellular uptake assessment of developed formulations were followed by using RAW 264.7 macrophage cell lines. Results revealed that after immunizing B16F10 melanoma cells implanted C57BL/6 mice with combination [endosomolytic and conventional nanocomposite(s)] of nanocomposite(s), a significant increase in the interleukins level i.e. IL-2, IFN-?, IL-12 and IL-6 and OVA Ag(s) specific antibody responses were recorded. Consequently, a strong immunological response was elicited with specific polarization contributing to humoral and activation of CD8⁺ to cellular responses. Finding of histological examination also support the potential of therapeutic outcome. The present approach based on mannose surface functionalization for targeting to antigen presenting cells and pH-dependent prompt endosomal release and escape can be a promising system for efficient cancer immunotherapy.