Survivin启动子调控sea基因真核表达质粒的构建及其在肺癌细胞中的特异性表达

目的构建Survivin启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达。方法以金黄葡萄球菌(ATCC25923)基因组为模板,PCR扩增sea基因。用sea基因替代以Survivin启动子为调控序列的pGL-S-RED质粒中的Red基因,构建真核表达质粒pGL-S-SEA。酶切及测序鉴定后,用脂质体转染A549细胞和MRC-5人胚肺成纤维细胞,RT-PCR检测两种细胞sea基因的转录情况。结果Survivin启动子调控的、以超抗原SEA编码序列CDS为目的基因的真核表达质粒pGL-S-SEA构建正确,并在A549细胞中启动了sea基因的转录,其强度为内参基因(GAPDH)的65.96%,而在MRC-5细胞对照中未检测到sea基因的转录。结论已成功构建Survivin启动子调控的sea基因真核表达质粒,Survivin启动子可在转录水平特异性地调控sea基因在A549细胞内表达,为下一步以其作为基因疫苗治疗肺癌奠定了基础。     

颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的构建人颗粒溶素(GLS)活性肽(9ku-GLS)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因的真核表达载体,并检测其在小鼠黑色素瘤细胞B16中的表达。方法经PCR扩增9ku-GLS基因,插入质粒pBudCE4.1中,经酶切及测序鉴定正确后,亚克隆至质粒pEGFP-C1中,将融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K转染B16细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白的表达。结果融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K经双酶切鉴定证明构建正确,转染B16细胞24h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,且经RT-PCR可扩增出267bp的目的基因片段。结论已成功构建9ku-GLS与EGFP融合基因的真核表达质粒,且在B16细胞中表达了融合蛋白。     

Smac-EGFP真核表达质粒的构建

目的构建EGFP融合表达第二线粒体源的半胱氨酸激活物(second mitochondria-derived activator of caspases,Smac)基因的真核表达质粒。方法提取He La细胞总RNA,逆转录合成c DNA,以其为模板,PCR扩增Smac基因,将其插入到p EGFP-N3质粒中,构建重组真核表达质粒p EGFP-N3-Smac,通过脂质体法转染He La细胞,于倒置荧光显微镜下观察转染后质粒在细胞中的分布表达情况,并采用Western blot法鉴定表达的融合蛋白Smac-EGFP。结果成功构建了真核表达质粒p EGFP-N3-Smac,转染后的He La细胞在细胞内膜周围即线粒体部位可见明显、规律的GFP表达;表达的融合蛋白Smac-EGFP相对分子质量约49 000。结论成功构建了重组真核表达质粒p EGFP-N3-Smac,并在He La细胞中表达了融合蛋白,为进一步研究Smac的功能提供了参考。     

双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为筛选携带报告基因的肿瘤细胞系提供分子工具。方法以质粒pcDNA3. 1、pcDNA6-GFP、pSVA-Luc为模板,分别扩增CMV、GFP和Luc基因序列,通过In-fusion法将3个基因片段与经HindⅢ、XhoⅠ双酶切的pcDNA3. 1载体连接,构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pC-T2A-Luc-GFP,转染293T细胞,荧光显微镜直接观察GFP的表达,化学发光仪检测Luc的表达。提取293T细胞总RNA,RT-PCR法扩增p53基因,通过In-fusion法将p53基因连接于质粒pC-T2A-Luc-GFP上,构建质粒pC-p53-T2A-Luc-GFP,转染293T细胞,Western blot法检测p53的表达,化学发光仪检测Luc的表达。结果重组真核表达质粒pC-T2A-Luc-GFP经酶切及测序鉴定构建正确,GFP和Luc双报告基因均可在293T细胞中正确表达,且可用于后续的动物模型建立。pC-p53-T2A-Luc-GFP质粒中p53的插入降低了Luc的表达,但其表达仍为阳性,不影响Luc的...     

MafA基因真核表达质粒的构建及其在人肝癌细胞HePG-2中的表达和作用

目的构建胰岛素启动子肌腱膜的纤维肉瘤肿瘤基因同系物A(MafA)基因的真核表达质粒,并观察MafA基因在人肝癌细胞HePG-2中的表达及其作用,为糖尿病基因治疗的研究奠定基础。方法提取小鼠胰腺组织总RNA,经RT-PCR扩增MafA基因片段,克隆至真核表达载体pEGFP-N2和pEGFP-C1中。用脂质体将重组表达质粒转染至人肝癌细胞HePG-2中,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测转染细胞中MafA和insulinⅡ基因的转录水平,Western blot检测融合蛋白EGFP-MafA的表达。结果重组表达质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA经PCR、双酶切和测序证明构建正确;重组质粒转染的HePG-2细胞有绿色荧光蛋白表达;经RT-PCR可检测到MafA基因表达,但未检测到insulinⅡ基因表达;经Westernblot检测,在相对分子质量约70 000处可见特异性反应条带。结论已成功构建了MafA基因真核表达质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA,以其转染的HePG-2细胞可表达MafA基因,并翻译成蛋白,但未表达insulinⅡ基因。     

人NIRF基因真核表达质粒的构建及其在HepG2.2.15细胞中的表达

目的构建人NIRF基因真核表达质粒,并在HepG2.2.15细胞中表达NIRF蛋白。方法从HeLa细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增NIRF基因编码区全长序列,插入到pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-NIRF,转染HepG2.2.15细胞,检测细胞中NIRF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平。结果重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-NIRF经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染HepG2.2.15细胞后,可检测到细胞中NIRF基因mRNA的转录及蛋白的表达。结论已成功构建了人NIRF基因真核表达质粒,并在HepG2.2.15细胞中表达了NIRF蛋白,为下一步研究其在肿瘤组织中的功能奠定了基础。     

Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒的构建及其在人肺癌细胞中的表达

目的构建胞内病原体抗性基因1(Ipr1)和绿色荧光蛋白(GFP)基因真核共表达穿梭质粒,并在人肺腺癌细胞A549中表达。方法采用PCR方法,分别从质粒pEGFP-C1-Ipr1和pEGFP-C1中扩增Ipr1和GFP基因,将GFP基因、分枝杆菌复制子OriM和Ipr1基因同时克隆入多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,构建pBud-GFP-OriM-Ipr1穿梭质粒,脂质体法转染A549细胞,荧光显微镜观察GFP的表达,免疫组化方法检测Ipr1蛋白的表达。结果酶切和测序分析表明,pBud-GFP-OriM-Ipr1真核共表达穿梭质粒构建正确。转染A549细胞后,荧光显微镜下可观察到转染细胞中有GFP表达,免疫组化法可检测到Ipr1蛋白的表达,且定位于细胞核内。结论已成功构建Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒,为进一步研究Ipr1抗结核的功能奠定了基础。     

原发性开角型青光眼致病基因MYOC真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建原发性开角型青光眼(POAG)致病基因MYOC的真核表达质粒,并在COS-7细胞中表达MYOC蛋白。方法用RT-PCR法扩增人眼组织(角膜缘)MYOC基因cDNA,纯化回收后,克隆入pGEM-T载体,再亚克隆入真核表达质粒pEGFP-N3,构建重组表达质粒pEGFP-N3-MYOC,转染COS-7细胞,用荧光显微镜观察MYOC蛋白在COS-7细胞中的表达,Western blot分析MYOC蛋白分泌特点。结果经酶切和DNA测序鉴定,证实重组表达质粒pEGFP-N3-MYOC构建正确,荧光显微镜观察MYOC蛋白能在COS-7细胞中表达,并且定位在细胞质中,而绿色荧光蛋白分布在整个细胞内。Western blot结果显示,MYOC蛋白能分泌到细胞外。结论已成功构建MYOC基因真核表达质粒,并能在COS-7细胞中表达MYOC蛋白,为进一步研究POAG发病机制奠定了基础。     

双启动子对增强型绿色荧光蛋白表达的影响

目的研究双启动子对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的影响及双启动子的启动效率。方法分别将H1、U2、U3和U6启动子克隆至pEGFP-N1载体中的MCS位点处,构建CMV与以上各个启动子的双启动子表达载体。将重组载体转染293T细胞,荧光显微镜观察,流式细胞术检测转染效率及EGFP基因的表达效率(以荧光指数表示)。结果双启动子重组表达载体经PCR和酶切证明构建正确。流式细胞术检测表明,pEGFP-N1载体与分别插入H1、U2、U3和U6启动子的双启动子重组表达载体的转染效率分别为26.57%±1.54%、28.57%±0.99%、16.14%±1.69%、22.63%±1.77%和17.89%±1.84%;EGFP基因的表达效率分别为142.79±31.26、103.59±25.90、19.67±0.52、58.16±14.58和15.40±1.92。结论CMV与H1启动子联合驱动EGFP的表达效果与CMV单独驱动相近,而CMV分别与U2、U3和U6启动子联合驱动EGFP的表达效果显著低于CMV单独驱动。     

绿色荧光蛋白融合表达HBsAg基因载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　构建绿色荧光蛋白融合表达HBsAg基因的载体 ,并检测其在COS 7细胞中的表达。方法　采用PCR获得HBsAg基因 ;利用该基因片段和质粒pEGFP 3.1的HindⅢ /KpnⅠ限制性酶切位点构建融合表达载体pGHBs 3.1;通过脂质体介导的方法将该载体转染到COS 7细胞中 ,用PCR法检测基因转染 ,ELISA检测HBsAg的瞬时表达 ,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达。结果　融合表达载体pGHBs 3.1转染COS 7细胞后 ,在细胞中检测到HBsAg基因片段 ,转染细胞培养上清中检测到HBsAg表达 ,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达。结论　表达载体pGHBs 3.1在COS 7细胞中获得了表达 ,表达的融合蛋白具有HBsAg和绿色荧光蛋白的双重活性 ,该载体可用绿色荧光蛋白作为报告基因观察HBsAg的表达及定位。     

Survivin在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨凋亡抑制因子Survivin在结直肠癌组织中的表达及其与各临床病理因素之间的相关性。方法应用RT-PCR技术检测58份结直肠癌组织及其癌旁正常组织标本中Survivin基因的表达,回顾性分析其与诸多临床病理因素间的相关性。结果在58份结直肠癌组织中,Survivin基因的阳性表达率为84.5%,而在癌旁正常组织中均不表达,二者差异有统计学意义。在癌组织中,Survivin的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位及组织分化程度无明显相关性,但与Dukes分期及有无淋巴结转移密切相关。结论Survivin基因在结直肠癌组织中高表达,并与病理分期、有无淋巴结转移等恶性临床病理特征有密切相关性,提示Survivin在结直肠癌的发生、发展及预后中发挥重要作用。     

Survivin-siRNA真核表达载体的构建及其对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的构建Survivin-siRNA真核表达载体,并探讨其对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。方法化学合成4条能转录出siRNA的模板DNA,各75个碱基,退火形成2条双链DNA,双酶切后插入pSUPER.basic载体。将阳性重组质粒转染SGC-7901细胞,进行细胞计数,并用MTT法检测细胞的增殖活性;半定量RT-PCR检测细胞Survivin基因mRNA的转录水平;流式细胞术检测细胞周期的变化。结果PCR和酶切鉴定表明Survivin-siRNA真核表达载体构建正确,其能下调SGC-7901细胞Survivin基因mRNA的转录水平,抑制SGC-7901细胞生长和增殖,并促进细胞凋亡,使G0/G1和亚G1期细胞增多,S期细胞减少。结论已成功构建了Survivin-siRNA真核表达载体,其能下调SGC-7901细胞中Survivin基因mRNA的转录水平,使细胞增殖减弱,凋亡增加,为RNA干扰技术应用于胃癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

FABP7基因真核表达载体的构建及其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的构建脑脂肪酸结合蛋白(BLBP/B-FABP,FABP7)基因的真核表达载体,并检测其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。方法采用逆转录方法从星型细胞瘤组织中扩增FABP7基因,双酶切后插入线性化的pcDNA3.1载体真核启动子下游,构建重组真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7后,采用半定量RT-PCR检测FABP7基因mRNA的表达,MTT法检测细胞的增殖活性、流式细胞术检测细胞的周期变化情况,并对细胞进行计数。结果FABP7基因重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染MCF-7细胞后48、72和96h,pcDNA3.1-FABP7组的细胞数和细胞的A490值均比pcDNA3.1空质粒组明显降低,G1期细胞百分含量均明显升高。结论已成功构建了FABP7基因的真核表达载体,该载体可抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖。     

JTV1基因真核表达质粒的构建及其在K562细胞中的表达

目的 构建JTV1基因真核表达质粒并稳定转染人白血病细胞系K562,检测转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平及其对K562细胞增殖的影响。方法从人外周血单个核细胞中克隆JTV1基因,并将其插入pcDNA3.1表达载体中,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1,经脂质体介导转染K562细胞,采用RT-PCR和Western blot法鉴定转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测JTV1稳定表达对K562细胞增殖的影响。结果重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1经双酶切及测序证实,目的基因已插入质粒中;人JTV1基因能在K562细胞中稳定表达;JTV1具有抑制K562细胞增殖的作用。结论已成功构建了JTV1基因真核表达质粒,并获得了稳定表达人JTV1基因的K562细胞克隆,为进一步研究人JTV1基因的功能及其与白血病细胞增殖及凋亡的相关性提供了细胞模型。     

RV-G/LTB双基因融合真核表达质粒的构建及其在Vero细胞中的表达

目的 构建RV-G/LTB双基因融合真核表达质粒,并在Vero细胞中表达.方法 应用重叠延伸PCR方法,采用一定的linker序列(Gly4Ser)2将已克隆的狂犬病病毒糖蛋白(Rabies virus glycoprotein,RV-G)基因片段和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(E.coli heat-labile e...     

人源抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达

目的构建人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞MCF-7中进行表达。方法以重组质粒pcDNA4.0-LL-37为模板,采用PCR法扩增LL-37/hCAP-18基因,连入pEGFP-c1质粒,构建真核表达载体pEGFP-c1-LL-37,瞬时转染人乳腺癌细胞MCF-7,采用激光共聚焦显微镜观察重组质粒的转染效率,RT-PCR法检测目的基因的表达。结果所构建的抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体经双酶切和测序证明构建正确,在瞬时转染MCF-7细胞48h后,目的基因转染效率较高,约为40%,RT-PCR结果显示,重组质粒转染的细胞可扩增出339bp的目的基因条带。结论已成功构建了人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞中获得表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定了基础。     

HCV复合多表位基因真核表达载体的构建及在真核细胞中的表达

目的建立丙型肝炎病毒(HCV)复合多表位基因的真核表达载体,并在COS7细胞中瞬时表达。方法用PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段;分别合成HCV E2区模拟表位和NS3~NS57个T或Th细胞表位基因;PCR方法将羧基端部分缺失的HCV核心区基因与合成的表位基因串联,克隆入真核表达载体pcDNA3·1(-),并通过脂质体瞬时转染COS7细胞。结果所构建的真核表达载体pcDNA3·1(-)-CtEm已成功转染COS7,间接免疫荧光和RT-PCR证实,pcDNA3·1(-)-CtEm可在COS7中表达复合多表位基因。结论已成功构建HCV复合多表位基因的真核表达载体,并在COS7细胞中瞬时表达,为进一步复合多表位的基因免疫奠定基础。