天麻抗真菌蛋白(GAFP)的N端序列测定及cDNA基因克隆

从新鲜天麻次生块茎中将天麻抗真菌蛋白（ＧＡＦＰ）提纯,然后测得其Ｎ端的３０个氨基酸,根据氨基酸序列设计了一段３０ｂｐ的核酸探针,从ｃＤＮＡ文库中筛选到了编码该蛋白的基因,为这一新型蛋白在抗真菌基因工程中的应用奠定了基础。     

一个编码XPA2同源蛋白的人视网膜cDNA的克隆

用同源筛选法从人视网膜ＣＤＮＡ分子库中克隆到一个与ＸＡＰＣＤＮＡ有高度同泊的ＣＤＮＡ序列,长１３８６ｂｐ,其第一１７－１１７１ｎｔ为一个完整的开放阅读框（ＲＯＦ）,编码３８４个氨基酸,其Ｃ端较ＸＡＰ２长５５个氨基酸,３’ＵＴＲ长２１８ｂｐ１３５５－１３６０ｎｔ为加尾信号序列ＡＡＴＡＡＡ,１３７７－１３８６ｎｔ为ＰｏｌｙＡ序列。由该ＣＤＮＡＯＲＦ推导的蛋白质被命名为ＡＩＰＨ,它在ＧｅｎＢａｎｋ的登录     

双价抗虫基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达

利用人工合成及密码子优化后的雪花莲凝集素（ＧＮＡ）基因,与人工合成的ＧＦＭｃｒｙＩＡ构建了双价基因中间载体。双价基因进一步亚克隆到植物表达载体ｐＢＩ１２１．１上,获得了带有两个抗虫基因ｃｒｙＩＡ及ＧＮＡ基因的高铲植物表达载体ｐＧＷ４ＢＡＩ,地载体中两基因的５’端、３’各加人与在植物中能增强基因转录和翻译有关的调控元件。通过根癌农杆菌介导叶盘法转化烟草Ｋ３２６,获得２８株卡那霉素抗性植株,随机抽取１     

热休克后表达受抑基因的mRNA差别显示和克隆

以人成骨肉瘤细胞株（ＨＯＳ－８６０３）作为热休克模型，用差别显示ｍＲＮＡ法（ｄｄｍＲＮＡ）筛选，发现和克隆了一个热休克后表达受抑的ｃＤＮＡ片段。在４３℃、４０分钟热处理后１小时，ＨＯＳ－８６０３细胞总ｃＤＮＡ图谱未见明显变化，但以该ｃＤＮＡ片段作为探针，ＲＮＡｄｏｔｂｌｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实，热休克后该基因的ｍＲＮＡ的量明显下降，而ｍＲＮＡ未见明显降解。我们将这个因热休克而选择性的表达受抑的基因命名为ＨＳＳＧ－１。对全长３１２ｂＰ的ｃＤＮＡ片段的序列分析表明，ＨＳＳＧ－１可能是一个未知的新基因。     

单向锚定PCR富集扩增在克隆低丰度基因转录本中的应用

利用国际生物信息资源，通过计算机检索寻找与已知功能基因具有高度同源的ＥＳＴｓ，据此设计特异的ＰＣＲ扩增引物，并通过单侧特异引物搭配ｃＤＮＡ分子库载体引物（锚定引物），在低严紧条件下扩增各种组织的ｃＤＮＡ分子库以富集目标片段。继以单向锚定ＰＣＲ扩增产物为模板，用双侧特异引物再次扩增，获得的特异扩增ＰＣＲ产物经测序证实之后，将其用作探针杂交筛选相应的ｃＤＮＡ文库并进而克隆目的基因的全长ｃＤ－ＮＡ。此方法用于三个人类新基因的全长ｃＤＮＡ的分离与克隆，结果全部获得成功。这三个人类新基因分别是Ｈ－ＲａｌＧＤＳ基因、Ｈ－ＣＩＳ基因和Ｈ－Ｓ６ＰＫ基因，它们在ＧｅｎＢａｎｋ数据库的登录号分别是：ＡＦ０２７１６９、ＡＦ０３５９４６及ＡＦ０３７４４７。本文结果提示这一方法对于应用现有的人类基因组生物信息资源，克隆具有重要生物学功能的人类新基因，尤其是克隆呈低丰度的基因转录本全长序列具有较高的实用价值。     

运用一步化体外转录—翻译系统筛查基因突变的新技术

报道了一种筛查基因突变的新技术－ＰＣＲ结合一步化体外转转录－翻译系统。该技术包括：（１）ＰＣＲ扩增靶ＤＮＡ片段，并使ＤＮＡ产物的一端或两端带上Ｔ７Ｔ１序列；（Ｔ１：翻译起始信号，ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧ）；（２）以核的为模板，利用一步化体外转录－翻译系统合成相应肽链；（３）用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及高分辨ｐＨ梯度ＰＡＧＥ（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离分析多肽产物，通过异常电泳图谱而发现基因突变，本文以已知突变的     

一个编码XAP2同源蛋白的人视网膜cDNA的克隆

用同源筛选法从人视网膜ｃＤＮＡ分子库中克隆到一个与ＸＡＰ２ｃＤＮＡ有高度同源的ｃＤＮＡ序列,长１３８６ｂｐ,其第１７—１１７１ｎｔ为一个完整的开放阅读框（ＯＲＦ）,编码３８４个氨基酸,其Ｃ端较ＸＡＰ２长５５个氨基酸;３ＵＴＲ长２１８ｂｐ,１３５５—１３６０ｎｔ为加尾信号序列ＡＡＴＡＡＡ,１３７７—１３８６ｎｔ为ＰｏｌｙＡ序列。由该ｃＤＮＡＯＲＦ推导的蛋白质被命名为ＡＩＰＨ,它在ＧｅｎＢａｎｋ的登录号为：ＡＦ０３８４３７。它与ＸＡＰ２的氨基酸一致率为４２％,相似率为６１．７％。计算机分析结果显示：推导的ＡＩＰＨ蛋白与乙肝病毒Ｘ蛋白（ＨＢＸ）有三个较高同源的区域。其中两个对应于ＨＢＸ的反式转录激活功能结构域。ＡＩＰＨｃＤＮＡ与人体１６种组织ｍＲＮＡ的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果显示：这个来源于视网膜的转录本也可在骨骼肌和心脏中见到,杂交带长度约１．９Ｋｂ;此外在骨骼肌和心脏及其它１４种组织中还可见到另一个长约５．８Ｋｂ的杂交带     

中日美三国包装高等教育比较

中日美三国包装高等教育比较金潇明，刘玉生ＡＣＯＭＰＡＲＩＳＯＮＯＮＨＩＧＨＥＤＵＣＡＴＩＯＮＦＯＲＰＡＣＫＡＧＩＮＧＩＮＣＨＩＮＡ，ＪＡＰＡＮＡＮＤＴＨＥＵ．Ｓ．Ａ．￥ＪｉｎＸｉａｏｍｉｎｇ；ＬｉｕＹｕｓｈｅｎｇＡｂｓｔｒａｃｔ：Ａｆｔｅｒｔｈｅｅｆ...     

小片段红系特异增强子对MEL细胞中外源β珠蛋白基因表达调控的作用

在以往研究基础上，本文进一步采用了１００ｂｐ红系特异增强子，构建了反转录病毒重组体Ｎ＿２Ａ·β·Ｅ１００和Ｎ＿２Ａ·β·Ｅ１００，经Ψ－２和ＰＡ３１７两轮包装细胞系转染后，利用出芽的病毒粒子感染ＭＥＬ细胞，检测外源基因的整合与表达。结果表明１００ｂｐ和３６ｂｐ之间的差异序列对病毒滴度和前病毒整合无明显影响，但能使外源β珠蛋白基因的表达水平提高约一倍。     

等温条件下序列特异性核酸扩增技术：NASBA

介绍了一种能在等温条件下进行序列特异性核酸体外扩增的技术──ＮＡＳＢＡ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｐｅｃｉｆｉｃ－ＢａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）。该技术同时使用ＡＭＶ反转录酶、Ｔ７ＲＮＡ聚合酶及ＲＮａｓｅＨ，在同一个恒定温度下协同作用，使特异的核酸序列得以扩增至１０６～１０８倍。起始的模板可以是ＲＮＡ，也可以是ＤＮＡ，尤其适用于微量ｍＲＮＡ的特异性扩增。本文研究了各种因素对ＮＡＳＢＡ扩增效率的影响，找到了最适反应条件。并成功地从人脐带血总ＲＮＡ中扩增了人Ｔ细胞受体γ链ｍＲＮＡ。     

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的克隆及其转基因烟草抗虫性初探

从未成熟的大豆叶中提取总ＲＮＡ，利用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂基因单一目的片段，克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）ＳｍａＩ位点上。序列分析表明，该基因与报导的序列高度同源：其核苷酸序列及推论的编码氨基酸序列的同源率分别为９９．５％和９８．２％。由此，构建了大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂基因的植物高效表达载体ｐＢｉｎＳＫＴＩ。并采用农杆菌介导的叶盘法转化了烟草，获     

致病性鳗弧菌金属蛋白酶基因克隆及序列分析

从我国山东沿海发病的鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到一株致病性鳗弧菌（Vibrio anguillarum）W-1，该菌的胞外蛋白酶活性为4226u/ml，部分纯化的胞外蛋白酶对海水养殖大菱鲆鱼有一定的毒性。应用PCR扩增，从鳗弧菌W-1染色体DNA扩增出一条长约1.925kb的特异性PCR产物，DNA序列分析表明：克隆的片段含有完整的金属蛋白酶基因阅读框，编码611个氨基酸残基的蛋白质，该金属蛋白酶基因与一株致病性鳗弧菌蛋白酶基因的核苷酸及氨基酸序列同源性为100%，而与解蛋白弧菌（V.proteolyticus)、创作弧菌（V.vulnificus）、霍乱弧菌（V.cholerae)、斑点气单胞菌（Aeromonas punctata），嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的氨基酸序列同源性分别为73%、70%、69%、53%、51%。     

大菱鲆红体病虹彩病毒ATPase基因的克隆与序列分析

克隆了大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)的重要功能蛋白——腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphatease,ATPase)基因的全部编码区及其上下游部分的核苷酸序列。经多序列比对和分析发现,TRBIV与GenBank中6种代表性虹彩病毒的同源性介于35％～98％之间。绘制出的包含TRBIV在内的14种虹彩病毒的系统发育树证实,TRBIV是一种新的鱼类虹彩病毒,其分类地位处在虹彩病毒科待指定病毒属内的真鲷虹彩病毒亚群和传染性脾肾坏死病毒亚群之间。     

从鳗弧菌M3 Fosmid文库筛选aroA基因

为克隆鳗弧菌aroA基因 (它在细菌中编码合成芳香族氨基酸的关键酶--5-烯醇氏丙酮酰莽草酸3-磷酸(EPSP)合成酶),在实验室中构建了鳗弧菌M3大分子量基因组Fosmid文库,并通过克隆测序获得了部分序列,以此为基础,通过延伸测序获得了ar oA基因序列全长. 该基因全长1281bp,编码427个氨基酸,包含一个11个氨基酸残基的信号肽;编码区GC平均含量为46.8%,推测分子量为46177 Da.相似性分析表明,鳗弧菌的aroA核苷酸和氨基酸序列与其他弧菌的相似性最高,分别在73%～75%和78%～82%;进化树结果也表明鳗弧菌ar oA与其他弧菌的亲缘关系最近.aroA基因的克隆为构建鳗弧菌弱毒疫苗奠定了基础.     

大熊猫朊病毒基因克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊病毒基因序列设计引物对,采用PCR方法扩增了大熊猫的朊病毒基因,将其克隆到T-Easy载体,序列测定及分析表明所克隆的大熊猫PRNP基因(GeneBank收录号为AF327449)片段为795bp,编码264个氨基酸的前体蛋白,推测其分子量约28．5ku。与已报道的牛(GeneBank收录号为AF455119)、绵羊(GeneBank收录号为AF367623)的相应序列作比较分析,核苷酸序列同源性分别为99％和83％,其编码的氨基酸同源性均为100％。在所克隆的大熊猫PRNP基因中未发现与朊病毒敏感性连锁的氨基酸多态性位点。     

华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达

通过3次PCR程序克隆得到了华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶全基因序列,该基因的开放阅读框长1170bp,不含内含子,编码一个389个氨基酸残基的蛋白质,包括26个氨基酸的信号肽,94个氨基酸的前导序列和269个氨基酸的成熟肽,其推断的氨基酸序列与一些已报道的根霉脂肪酶序列同源性为86%.在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中分泌表达前导肽序列.SDS-PAGE分析表明表达蛋白的分子量约37kD.N-端氨基酸序列分析表明该重组蛋白分泌过程中前导序列N-端的67个氨基酸被切割掉,表达的重组脂肪酶由前导序列C-端的27个氨基酸和成熟肽的269个氨基酸组成.发酵132h后上清中重组脂肪酶的表达量最高,蛋白含量约5.4mg/mL,橄榄油乳化法测水解酶活为161U/mL,其比活比野生型华根霉脂肪酶高约43倍.     

15N/14N position-specific isotopic analyses of polynitrogenous amino acids

15N/14N isotope ratios are widely used to study processes and systems involving amino acids. Nitrogen isotope fractionation in biological processes occurs primarily at sites of bond-breaking and formation; the finest discrimination for "isotopic fingerprinting" and studies of isotopic fluxes is thus obtained at the position-specific level. While there are numerous reports of natural intramolecular carbon isotope variability, there are no literature reports of 15N/14N position-specific isotopic analysis (N-PSIA) of biologically relevant molecules. We report a methodology for high-precision N-PSIA of four polynitrogenous alpha-amino acids (asparagine, glutamine, lysine, histidine) and the first survey of natural intramolecular 15N/14N in these biomolecules. Selective liberation of N-atoms from multiple commercial standards of each parent amino acid was achieved by an appropriate enzymatic reaction or by acid hydrolysis. 15N/14N measurements were performed on N-ethoxycarbonyl ethyl ester derivatives of the parent amino acids and their analogues by gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometry, and the average precision for replicate injections was found to be SD(delta15N) = 0.3%. Position-specific delta15N values of the parent amino acid were directly observed or indirectly calculated using mass balance. The average precision obtained for directly measured positions was SD(delta15N) = 0.2-0.4%. The average precision for indirectly obtained positions was SD(delta15N) = 0.6-1.3% as a result of propagation of errors. Enrichment in the side chain-N with respect to the peptide-N was observed in nearly all of the amino acid sources, most notably in asparagine (average delta delta(side-peptide) = + 11%), which may be indicative of its method of production. In some cases, it was possible to distinguish commercial sources by N-PSIA that could not be distinguished at the compound-specific level.     

斑马鱼ILF2基因的电子克隆分析

利用电子克隆方法,成功获得了ILF2基因在斑马鱼中的同源基因,为进一步研究斑马鱼ILF2基因功能奠定了基础.斑马鱼ILF2基因cDNA全长为1560bp,含有一个编码387个氨基酸的完整开放阅读框架.比较斑马鱼ILF2基因和人ILF2基因,显示两者编码氨基酸序列相似性为87%,核苷酸序列有72%相同.     

脆壁克鲁维酵母KfADE5,7基因的克隆及其5''''非编码区结构与功能研究

通过补偿乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)KlADE5,7基因突变,从脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)基因组文库中克隆了KfADE5,7基因.该基因全长4975bp,编码793个氨基酸,氨基酸序列与已知的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ScADE5,7基因编码区有68.3%的同源度.利用KfADE5,7-lacZ融合基因,对5'非编码区进行缺失分析,发现了具有完整启动子功能的区域,在启动子上游还发现了两个增强转录和两个减弱转录的区域.     

鲈鱼蛋白质感染因子蛋白基因的克隆和结构分析

采用RT-PCR方法分离了鲈鱼蛋白质感染因子蛋白编码基因序列,并进行了结构分析。研究证明,该感染因子蛋白由507个氨基酸组成,与红鳍东方、大西洋鲑蛋白质感染因子蛋白的平均相似性为67．9％,预测分子量约54kD,具有信号肽、短肽顺接重复、疏水区、糖基化位点、二硫键、糖基缩醛磷肌醇锚定位点等蛋白质感染因子蛋白的主要特征结构域。鲈鱼蛋白质感染因子蛋白编码基因序列的分离,为蛋白质感染因子的进化、功能研究以及可能存在的鱼类传染性海绵样脑病研究奠定了基础。