麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

枯草芽孢杆菌淀粉酶高产菌株的复合诱变研究

该研究以实验室保存的枯草芽孢杆菌为出发菌株,利用紫外和硫酸二乙酯（DES）复合诱变的方法,从大量突变菌株中获取可高效发酵生产淀粉酶的菌株。又通过连续传代实验,确定了该突变菌株突变性状能稳定遗传。结果表明,菌株D-2具有较高的的淀粉酶活力,其淀粉酶活力可达N6．599U／mL,较出发菌株提高到4倍。并在连续培养5代后,仍具有较好的遗传稳定性。该文探讨了一种高效的发酵生产淀粉酶菌株的选育方法,为下一步菌种生长条件优化打下了基础。     

带自身启动子的bgaB基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的启动子连同β-半乳糖苷酶bgaB基因经PCR扩增后,连接在T载体上,再取代枯草杆菌载体pZ01-bgaB的启动子,将其在枯草杆菌宿主WB600中表达.经摇瓶发酵20h,得到乳糖酶活力6.37U/mL,比活力3.814U/mg,SDS-PAGE电泳显示有明显重组蛋白质条带.证明了嗜热脂肪芽孢杆菌来源的启动子在枯草杆菌中是完全适用的.     

1株古细菌海藻糖合成酶系在枯草芽孢杆菌中的诱导表达

来源于古细菌嗜酸硫化叶菌（ S u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s ） 的麦芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosylterhalose synthase,MTSase）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyltrehalose trehalohydrolase,MTHase）联合作用,可以利用淀粉为底物生成海藻糖。本研究构建了6 种枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体,将密码子优化后的MTSase和MTHase编码基因在木糖异构酶基因的启动子及其阻遏蛋白介导下实现了在枯草芽孢杆菌中的功能表达,木糖启动子分别来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。在以5 g/L甘油为碳源,24 g/L蛋白胨为氮源时,菌体培养8 h后加入终质量浓度为6 g/L的木糖,37 ℃诱导16 h后重组MTSase、MTHase产生联合作用,海藻糖转化率达到33.57%。实现了MTSase、MTHase在枯草芽孢杆菌中的功能表达。     

适应性进化和改造质粒稳定性促进枯草芽孢杆菌合成N-乙酰神经氨酸

N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,NeuAc)作为营养化学品和药物中间体在保健品和医药领域具有广泛的应用.为了提升重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)合成NeuAc的产量,首先利用NeuAc生物传感器(NeuAc-Biosensor)调控抗生素抗性基因表达,在抗生素存在...     

耐高温β-半乳糖苷酶的分离纯化与酶学性质分析

为从嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)XG24 发酵液中纯化到β- 半乳糖苷酶,并对酶学性质进行研究,利用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析和Sephadex G-75 分子筛凝胶过滤层析等方法进行分离纯化。结果表明：经过系列步骤纯化后,酶纯度提高了54.5 倍,回收率20.4%,酶比活力达32.7U/mg。以邻- 硝基酚-D- 半乳糖吡喃糖苷(ONPG)为底物,研究β- 半乳糖苷酶的酶学性质。最适pH6.5,最适作用温度65℃。此菌株产β- 半乳糖苷酶在70℃以下和pH4.0～8.0 范围内具有较好的稳定性;Mg2+、Mn2+、Fe2+和Co2+ 对此酶有明显激活作用,而Cu2+、Ag+、Hg2+ 几乎完全抑制酶活性。以ONPG 为底物酶的Km 值为4.32mmol/L。SDS-PAGE 和凝胶过滤层析测得酶蛋白为单肽链蛋白,表观分子质量64kD。因此,嗜热脂肪芽孢杆菌XG24 β- 半乳糖苷酶在乳制品工业中具有潜在的应用价值。     

Streptomyces lavendulae X33海藻糖合酶基因克隆及酶学特性

目的：对菌株Bacillus sp. B110的胞内麦芽糖淀粉酶BMAL进行基因克隆、异源表达、纯化及酶学性质研究,为后期开发新的淀粉加工用酶打下基础。方法：使用PCR技术对Bacillus sp. B110的胞内麦芽糖淀粉酶bmal基因序列进行全长克隆,异源表达,使用Ni²⁺-NTA进行纯化,再对其酶学特性进行测定,使用序列分析工具BioEdit、MEGA等对其氨基酸序列进行分析,使用AlphaFold2对其三级结构进行预测分析。结果：BMAL基因全长1770 bp,编码一个589氨基酸残基的蛋白。重组酶rBMAL经Ni²⁺-NTA亲和层析纯化后,SDS-PAGE电泳结果显示其分子量大小为63 kDa。氨基酸序列分析和三维建模表明BMAL与来源于B.subtilis 168和B.subtilis SUH4-2的麦芽糖淀粉酶有较高的一致性,且BMAL具有一个麦芽糖淀粉酶所独有的N端结构域以及由Asp328-Glu357-Asp424三个氨基酸残基所构成的催化中心。重组酶rBMAL最适反应温度为45 ℃,最适反应pH为6.0。重组酶rBMAL在30 ℃条件下保藏7 h残留酶活为60%,但在60 ℃条件下保藏2 h残留酶活力下降98%,说明BMAL对热敏感。重组酶rBMAL在4 ℃,pH7.0~9.5保藏12 h活性稳定。当存在1 mmol/L的金属离子Mg²⁺时,重组酶rBMAL活力提高36%,而Ni²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Ca²⁺对重组酶rBMAL有抑制作用,酶活力减少85%~48%。有机溶剂和化学试剂甲醇、乙醇、丙酮、异腈、EDTA和SDS对重组酶rBMAL有较强的抑制作用,酶活力减少至32.3%~64.8%。底物特异性实验结果证实BMAL最适底物为环精糊。结论：Bacillus sp. B110的胞内麦芽糖淀粉酶BMAL具有良好的催化特性和pH稳定性,在面包烘焙工业上具有潜在的应用价值。     

产酱香枯草芽孢杆菌质粒与酱香产生关系的探讨

对2株产酱香枯草芽孢杆菌E20、B1⑥进行质粒提取和消除,得到质粒消除菌RE20、RB1⑥,通过蛋白含量、酶活测定等实验研究的结果发现,E20、B1⑥与RE20、RB1⑥在总蛋白含量、总蛋白酶活性、总淀粉酶活性以及对美拉德模式反应的褐变催化作用上差异均不显著;其胞外蛋白SDS-PAGE电泳图谱亦无差异。证明2菌携带的质粒与酱香风味物质的产生并无直接关系。由此推测,实验菌株酱香风味物质产生的相关基因不在质粒上,而是位于染色体组上。     

芽孢杆菌B15胞外蛋白酶和淀粉酶的酶学性质研究

为探索芽孢杆菌B15胞外蛋白酶和淀粉酶在饲用酶制剂方面的应用,试验对其产酶情况及胞外酶的酶学性质进行了研究。结果显示,该菌株产蛋白酶和淀粉酶的最高酶活性分别为(181.9±3.5)U/mL和(50.2±1.6)U/mL。蛋白酶和淀粉酶的最适作用温度范围分别为40℃～50℃和40℃～70℃,最适作用pH值为7和5～7。蛋白酶和淀粉酶经40℃～50℃热处理,以及在pH值为5～9的缓冲液中较稳定。蛋白酶被EDTA所抑制,属金属蛋白酶,金属离子(10mmol/L)Mg2+和K+对其有激活作用,Fe2+有抑制作用,而Fe2+对淀粉酶有一定的激活作用。     

Optimization of encapsulation of maltogenic amylase into a mixture of maltodextrin and beeswax and its application in gluten-free bread

In this work maltogenic amylase (MAase) was encapsulated into the mixture of maltodexrin and beeswax (BW) for retarding staling of gluten-free bread. The effects of maltogenic amylase (MAase) concentration (8.2, 45, and 82 mg/ml), maltodextrin with dextrose equivalent (DE) 4–7 (MD) (1, 2.5, and 4%) and, BW (1, 2.5, and 4%) on the encapsulation efficiency (EE) of encapsulated enzyme were optimized using RSM. The optimized formulation was MAase with 8.2 mg/ml, MD 4% and BW 1%, leading to the highest EE (79.35%), thus chosen for subsequent experiments. The prepared particles were 1,190.50 nm with PDI of 0.336 and zeta potential of −8.30 mV. Surface morphologies of produced particles were almost spherical with layered appearance. Batter with this formulation led to higher cross over point in frequency sweep than free enzyme-loaded batter. Lower weight loss, higher volume index, darker crust color, whiter crumb color, more aerated microstructure, less hardness in crumb, and higher sensorial acceptability on the first day and during storage period in the breads containing encapsulated MAase was observed.     

N-乙酰神经氨酸合成途径在枯草芽孢杆菌的构建

对食品安全认可的枯草芽孢杆菌进行菌株改造,利用生物发酵法制备N-乙酰神经氨酸。首先通过基因合成获取来自枯草芽孢杆菌溶源体的P_holin启动子并构建了p MK4-P_holin-GFP质粒,转入枯草芽孢杆菌,以GFP为报告基因,对P_holin及其它常见的强启动子进行了转录效率的比较,然后将优化后的P_holin用于构建N-乙酰神经氨酸表达质粒p MK4-P_holin-neu BC。研究结果显示:P_holin启动子是一种优异的枯草芽孢杆菌组成型强启动子,在利用LB进行发酵培养的实验中,P_holin的转录效率为同样方式构建下的P43启动子的2.62倍。通过N-乙酰神经氨酸表达质粒,可以成功地在枯草芽孢杆菌168菌株中实现N-乙酰神经氨酸的重组生产,摇瓶培养中N-乙酰神经氨酸的产量为0.226 g/L。本文为枯草芽孢杆菌进行N-乙酰神经氨酸的工业化发酵生产奠定了研究基础。      

纳豆激酶稳定性的研究

纳豆激酶是一种新型溶栓酶 ,具有溶栓效率高、药效时间长以及无毒副作用等优点。实验研究了pH、温度、金属离子以及某些有机物质对该酶稳定性的影响。实验表明 ,该酶在 4 5℃以下和 pH 7～ 9范围内酶活相对稳定 ;Mg2 +和Co2 +离子对酶活有激活作用 ,而Cu2 +、Zn2 +和Al3+等离子对该酶有明显的抑制作用 ;牛血清蛋白、蛋白胨、明胶、甘油、丙二醇和海藻酸钠等能显著提高酶的耐热性 ,其中以明胶的作用最为明显。这些发现对液体酶的生产有重要指导作用     

枯草芽孢杆菌内切木聚糖酶的纯化与性质研究

建立了一种快速、简便分离纯化木聚糖酶的方法。采用活性聚丙烯酰胺凝胶电泳和均质提取法相结合 ,从枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)固态培养基发酵产物中分离得到了 2种内切木聚糖酶 ,分别定义为xylⅠ和xylⅡ ,它们水解桦木木聚糖的主要产物有木二糖、木三糖和聚合度更高的木聚寡糖 ,没有木糖。SDS PAGE显示内切木聚糖酶xylⅡ为单肽链结构 ,分子质量为 98 8ku。内切木聚糖酶xylⅡ的酶反应最适温度为 5 0℃ ,酶反应的最适 pH为 7 0。Mn2 + 对xylⅡ酶反应具有促进作用 ,将酶活提高了 2 7倍 ,而Fe3+ 对该酶反应起完全抑制作用。     

纳豆激酶的纯化及性质研究

从固态发酵培养的纳豆中提取纳豆激酶 ,采用盐析、疏水层析、离子交换层析等方法 ,对提取液进行纳豆激酶的分离纯化。经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 ,活性酶蛋白为单一组分 ,并测得其分子质量为 2 8ku。纳豆激酶在pH5 0～ 1 0 0 ,4～ 3 7℃范围内具有较好的稳定性 ,其纤溶活性可被 0 1mmol/L的PMSF完全抑制。体外溶栓实验表明 ,纳豆激酶为纤溶酶而不是纤溶酶原激活剂。     

Cloning and Expression of a Limonene Degradation Pathway from Bacillus stearothermophilus in Escherichia coli

The pathway encoding limonene catabolism was cloned as a 9.6kb chromosomal fragment from Bacillus stearothermophilus strain BR388 into Escherichia coli. It conferred growth on limonene as a sole carbon source and bioproduction of α-terpineol, perillyl alcohol, and perillyl aldehyde. Incubation of the recombinant with perillyl alcohol resulted in formation of perillyl aldehyde and perillic acid. Catabolic pathways apparently affected the microbial toxicity of limonene.     

紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应研究

枯草芽孢杆菌是一种无毒副作用、无残留的绿色饲料添加剂,研究表明,可以利用枯草芽孢杆菌进行生物防治或生产微生物杀菌剂以替代剧毒化学药品。利用紫外线对枯草芽孢杆菌进行诱变,通过实验紫外线处理150s时致死率几乎为100%,120s时诱变效果最好,对大肠杆菌的抑菌效果最明显。     

枯草芽孢杆菌BS-06抗真菌物质的特性研究

枯草芽孢杆菌BS-06能够产生抗真菌物质.本实验主要研究该菌株所产的抗真菌物质的部分特性.发现产生的抗真菌物质对热稳定性不佳,在酸性条件下容易失活,而在中性偏碱(pH 6～10)的条件下抑菌活性较高.此抗真菌物质对乙酸乙酯敏感,对石油醚和正己烷不敏感,不能被石油醚、正己烷抽提到有机相.甲醇、乙醇和丙酮会使抗真菌物质发生变性沉淀.     

枯草芽孢杆菌QM11漆酶基因克隆表达及序列分析

为获得高效表达的产漆酶工程菌,将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的漆酶（cotA）基因在大肠杆菌中表达。用PCR的方法从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）QM11基因组中扩增cotA基因,连接载体pET22b构建成表达载体pET22b-cotA,转化至E.coli BL21（DE3）进行诱导表达,最终通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况。克隆得到的cotA基因含有1542个核苷酸,由513个氨基酸组成,预测相对分子量为58 ku,理论等电点为5.91,无信号肽,二级结构以β-折叠和无规卷曲为主,其中β-折叠占26.71%,无规卷曲占52.05%,与NCBI已公布的Bacillus subtilis漆酶cotA基因（Gen Bank:GQ184294.1）碱基序列有12个碱基的差异,其编码的氨基酸序列有4个发生了改变。通过SDS-PAGE检测,目标蛋白相对分子质量约为54 ku,与预测相对分子量基本相符。