枯草芽孢杆菌内切木聚糖酶的纯化与性质研究

建立了一种快速、简便分离纯化木聚糖酶的方法。采用活性聚丙烯酰胺凝胶电泳和均质提取法相结合 ,从枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)固态培养基发酵产物中分离得到了 2种内切木聚糖酶 ,分别定义为xylⅠ和xylⅡ ,它们水解桦木木聚糖的主要产物有木二糖、木三糖和聚合度更高的木聚寡糖 ,没有木糖。SDS PAGE显示内切木聚糖酶xylⅡ为单肽链结构 ,分子质量为 98 8ku。内切木聚糖酶xylⅡ的酶反应最适温度为 5 0℃ ,酶反应的最适 pH为 7 0。Mn2 + 对xylⅡ酶反应具有促进作用 ,将酶活提高了 2 7倍 ,而Fe3+ 对该酶反应起完全抑制作用。     

枯草芽孢杆菌B2(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛.将编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-XYN.初步研究表明:以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程菌摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可迭1542.6 U/mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性.     

小麦麸皮阿魏酸的制备

本文以小麦麸皮为原料，采用碱法和酶法制备阿魏酸，通过正交试验确定出制备阿魏酸的最佳工艺参数，碱液浸提法阿魏酸最高释放量为3.08mg／g麦麸，最优组合是碱液浓度为1％，温度为80℃，提取时间为4h，麸皮粒度为80目；酶法提取的最高释放量为3、35mg／g麦麸，最优组合是料液比1：20．混合酶浓度1％。混合酶作用时间3h。另外，碱处理后的反应液颜色为深棕色，褐变较为严重；混合酶处理后反应液颜色较浅。酶法提取效果较佳。     

Bacillus pumilus WL-11蛋白酶对其木聚糖酶合成的影响

研究了不同的营养条件下短小芽孢杆菌WL-11产蛋白酶和木聚糖酶的情况。结果表明,碳源对WL-11木聚糖酶的合成具有诱导或抑制作用,对其蛋白酶的合成影响并不显著;氮源对WL-11木聚糖酶的合成不具有直接的调节作用,而可能通过调节其蛋白酶的合成量来间接影响其木聚糖酶的合成,且两者的合成量之间存在一定的正相关。     

耐酸Bacillus velezensis P7木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达及优化

为获得适应于酒糟酸性环境的木聚糖酶,将内源微生物耐酸性环境的野生Bacillus velezensis P7木聚糖酶基因克隆到枯草芽孢杆菌WB800中,纯化后通过SDS-PAGE电泳显示出约40 ku的蛋白多肽。为增加枯草芽孢WB800-P7工程菌株在高密度发酵中细胞外分泌木聚糖酶的产量,进行诱导和培养条件优化,用正交试验分析得出温度对产酶影响最大,确定菌株分泌重组蛋白的条件结果表明：最佳诱导条件为OD600 0.8、IPTG 1.2 mmol/L,最佳发酵条件为pH 6.0、培养温度35 ℃、接种量2%、摇床转速160 r/min。在该条件下发酵16 h,经重复验证,酶活力达到4.21 IU,与优化前相比,酶活力提高了64.45%。并探究重组酶的耐受性,结果表明在强酸性到中性条件下（pH 5.0~7.0）,其残余酶活力达到初始酶活力的80%以上。试验成功构建了木聚糖酶工程菌并较好表达蛋白,且重组木聚糖酶在酸性条件的耐受性良好。     

小麦麸皮阿魏酸的制备

本文以小麦麸皮为原料,采用碱法和酶法制备阿魏酸,通过正交试验确定出制备阿魏酸的最佳工艺参数,碱液浸提法阿魏酸最高释放量为3.08mg/g麦麸,最优组合是碱液浓度为1%,温度为80℃,提取时间为4h,麸皮粒度为80目;酶法提取的最高释放量为3.35mg/g麦麸,最优组合是料液比1∶20,混合酶浓度1%,混合酶作用时间3h。另外,碱处理后的反应液颜色为深棕色,褐变较为严重;混合酶处理后反应液颜色较浅。酶法提取效果较佳。     

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Promax NTG24发酵条件研究

本试验研究了不同碳源、氮源对B.subtilisProm ax NTG24产酶条件的影响。并运用正交设计确定了产酶培养基配方,同时还研究了溶氧、金属离子、起始pH值、菌龄与接种量对产酶的影响。研究表明,最佳产酶培养基为:2%玉米粉、1%甘油、3%豆粕粉、3%麸皮、0.4%Na2HPO4.12H2O、0.03%KH2PO4、0.25?C l2。Ca2 对产酶有强烈的激活作用,表面活性剂对产酶有激活作用但不明显。蛋白酶的生产对氧气需求比较严格,最适摇瓶装量为50mL/300mL。以24h菌龄接种量为3%对产酶最为有利,最佳起始pH为7.5。     

枯草芽孢杆菌B2（Bacillus subtiIis B2）木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛。将编码枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis B2）木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115／pPIC9K-XYN。初步研究表明：以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程茵摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可达1542.6U／mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性。     

小麦麸皮酶解产物对面包品质的影响

利用木聚糖酶直接酶解小麦麸皮,将酶解液浓缩后加入面粉,用面粉粉质和拉伸特性探讨酶解戊聚糖对面粉品质的影响,并用面包的烘烤失水量、比容、面包芯水分、质构等参数考察酶解戊聚糖对面包品质的影响。结果表明:木聚糖酶能酶解小麦麸皮中的水不溶性戊聚糖。酶解液对低筋粉的改善作用最明显,其中以料液比1:8(m:V),反应温度50℃,酶解时间90min,酶用量5mL/20g(酶液/麸皮,酶活400U/mL)的酶解液,在添加量为1.0%(以酶解液中含有的戊聚糖计,1g戊聚糖/100g面粉)时,对面粉和面包的品质改善效果最佳。     

信号肽对Bacillus subtilis表达环糊精葡萄糖基转移酶的影响

将来源于作者所在实验室构建保存E.coli p ET-20b(+)/CGT△E-CBMAmy的CGT△ECBMAmy基因插入6种含有不同信号肽(est A、bpr、vpr、ync M、yvg O和ywb N)的穿梭质粒p MA0911-SPs中,构建了6种重组表达载体并将其转入表达宿主B.subtilis WB600中,获得了6株重组菌。在相同的发酵条件下,est A信号肽介导的分泌效果最好,L-抗坏血酸2-葡萄苷产量达到0.81 g/L,明显高于其他5株重组菌。选取WBp MB/CGT△E-CBMAmy作为出发菌株,进行了摇瓶发酵条件优化,实现了CGT△E-CBMAmy酶的高效表达,最终使AA-2G产量提高了2.16倍,VC转化率达到21.9%。     

枯草芽孢杆菌发酵小米糠对其抗氧化肽含量与抗氧化活性的影响

为提高小米糠的附加值,本实验以多个枯草芽孢杆菌为起始菌株,透明圈直径与菌落直径之比（HC值）为初筛指标,通过酪蛋白平板培养法进行高产蛋白酶菌株的初步筛选。将初筛所获得菌株在小米糠基础培养基上进行发酵,对其发酵上清液的总蛋白酶活力、多肽含量及总抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）进行测定,进一步筛选出最适菌株。用此菌株对小米糠进行发酵,并对其最适发酵时间及上清液的抗氧化活性进行测定。结果表明：NattoD-3为最佳发酵菌株,其产蛋白酶活力为90.22 IU/mL,发酵小米糠72 h时所获得发酵上清液4 种体外抗氧化活性相对最高,分别为T-AOC值38.04 U/mL、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除率75.37%、总还原力0.18及Fe2+螯合能力44.34%,最终发酵上清液的多肽含量为4.28 mg/mL,纤溶酶活力为522.64 IU/mL。     

纳豆芽孢杆菌发酵麸皮的抗氧化功能研究

采用体外实验法比较了纳豆芽孢杆菌发酵麸皮的发酵液与未发酵麸皮水提液的抗氧化活性及其对H2O2所致红细胞氧化溶血的抑制作用.结果显示纳豆芽孢杆菌发酵麸皮能产生更强的抗氧化活性.麸皮发酵液比麸皮水提液表现出更强的还原能力,·OH和O2-·IC50的分别为8.2 mg/mL和24.0 mg/mL,分别比麸皮水提液高2.3倍和6.7倍;抑制猪油氧化实验表明麸皮发酵物的抑制活性更强,于VE相近.在对H2O2诱导红细胞氧化溶血的作用中麸皮发酵液比麸皮水提液的抑制效果更佳.     

纳豆激酶的纯化及性质研究

从固态发酵培养的纳豆中提取纳豆激酶 ,采用盐析、疏水层析、离子交换层析等方法 ,对提取液进行纳豆激酶的分离纯化。经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 ,活性酶蛋白为单一组分 ,并测得其分子质量为 2 8ku。纳豆激酶在pH5 0～ 1 0 0 ,4～ 3 7℃范围内具有较好的稳定性 ,其纤溶活性可被 0 1mmol/L的PMSF完全抑制。体外溶栓实验表明 ,纳豆激酶为纤溶酶而不是纤溶酶原激活剂。     

一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的纯化及酶学性质

利用乙醇分级沉淀(37.5%～60%)、SephadexG75凝胶过滤、Phenylsepharose6FF疏水色谱三步分离使一种枯草芽孢杆菌氨肽酶得到纯化,比活1.5567×106U/mg;SDSPAGE鉴定为纯酶,分子质量75ku,全酶含2个亚基。纯酶最适温度60℃,温度稳定范围20～70℃。最适pH8.5,pH稳定范围8.0～10.0。Zn2+、Ni2+有较大的抑制作用,Co2+则对酶活有较强的激活作用。酶活性中心可能结合了2个Zn2+,米氏常数Km为1μmol/L,最大反应速度Vmax为5000μmol/(L·min)。     

枯草芽孢杆菌纳豆激酶分离纯化及酶学性质

利用30%～70%饱和度的硫酸铵沉淀,Sephadex G-50凝胶过滤层析对浅盘发酵纳豆激酶进行分离纯化并对其酶学性质进行初步研究。以纤维平板法测定纳豆激酶活力,SDS-PAGE检验纯化效果。结果表明:纯化后纳豆激酶为电泳纯,分子质量约27.518kD,纯化倍数和酶活回收率分别为19和42.1%,纳豆激酶最适温度为50℃,最适宜pH值为8.0。     

小麦麸皮中戊聚糖的纯化分级及组成分析

用乙醇逐步沉淀和离子交换柱层析方法对麸皮中制备的水溶戊聚糖(WSP)和水不溶戊聚糖 (AEP)进行分级纯化 ,并对各组分的组成进行了分析 .结果表明 ,用乙醇逐步沉淀时 ,随着乙醇体积分数的增加 ,所得分级组分具有较高的分支 ;用离子交换柱层析时 ,WSP可分级为 2个组分 ,AEP可分级为 3个组分 ,并且用NaCl较H2 O洗脱的组分具有较高的分支和较高的相对分子质量     

麦麸多肽的分离纯化及抗氧化功能研究

采用碱性蛋白酶Alcalase 水解麦麸蛋白制备麦麸多肽,利用SephadexG-25 和DEAE-32 对麦麸多肽进行纯化,醋酸纤维素薄膜电泳法测定麦麸多肽纯度,用硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验、脱氧核糖法检测其对超氧阴离子自由基(O2·)和羟自由基(·OH)的清除能力,分光光度法测定小鼠红细胞溶血和肝线粒体膨胀程度。结果表明,分离纯化的麦麸多肽对O2·和·OH 的清除率别为53.16%、62.39%,并且具有明显抑制氧化溶血现象和·OH 诱导线粒体肿胀的作用,说明麦麸多肽具有较强的抗氧化功能。     

米糠和麦麸膳食纤维的制备研究

探讨了米糠半纤维素和麦麸膳食纤维的提取工艺。结果表明 :( 1 )料液比 1∶1 0 ,6 0℃浸提 3h ,米糠水溶性半纤维素提取率 1 38% ;( 2 )料液比 1∶1 0 ,0 5mol/L的NaOH 2 5℃浸提 3h ,米糠碱溶性半纤维素提取率 8 86 % ;( 3) 0 6 %的NaOH ,α 淀粉酶加入量 0 4% ,70℃浸提 1 5h ,麦麸膳食纤维提取率达 6 6 2 7%。     

枯草芽孢杆菌CF-3抑菌蛋白的分离与鉴定

本研究采用硫酸铵分级盐析、交联葡聚糖凝胶分子层析(Sephadex G-75)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)等方法对生防菌枯草芽孢杆菌CF-3无菌发酵液对复端孢霉F中的主要抑菌蛋白进行了分离与鉴定。结果表明:CF-3无菌发酵液中抑菌蛋白的硫酸铵最佳沉淀饱和度为60%~70%,蛋白质沉淀量为149.03μg/mL,极显著高于其他浓度(p≤0.01);利用60%~70%饱和度的硫酸铵提取的粗蛋白质经Sephadex G-75凝胶柱层析后获得2个吸收峰,8管收集液,其中第2管峰收集液抑菌活性显著高于其他管(p≤0.05);将流分2收集液进一步分离纯化后,将抑菌效果最好的2.3号流分的两条蛋白条带割胶回收,利用生物质谱技术鉴定为γ-谷氨酰转肽酶和胞内丝氨酸蛋白酶,分子量分别约为42.5 ku和33.9 ku。以上结果可为该菌株及其抑菌蛋白的开发应用奠定基础。