烟草CYP82E4基因启动子功能分析

烟碱转化是指在烟叶成熟期,烟叶中的烟碱大量转化成降烟碱,烟叶品质发生显著变化的过程。前期研究表明烟碱转化由烟碱去甲基酶一步催化完成,其编码基因为CYP82E4(NtE4)。为解析NtE4启动子功能,探究其调控机制,本研究通过在线数据库分析NtE4启动子上的顺式作用元件,预测其上游靶向转录因子;通过5’端缺失构建启动子融合GUS基因的重组表达载体并瞬时转化本氏烟,确定启动子活性区域。结果表明,NtE4启动子包含2个脱落酸、11个乙烯响应元件,9个WRKY和7个NAC结合位点等;-500～-1 000 bp是NtE4启动子核心区域,-500～-1 967 bp存在较多增强启动子活性的元件;预测ERF、WRKY和NAC为NtE4基因上游靶向转录因子;荧光定量表达分析显示ERF5、WRKY50和NAC29在叶片衰老过程中具有和NtE4相似的表达趋势。本研究将为阐明烟叶衰老过程中NtE4介导的烟碱转化机制提供理论依据。     

烟草转化株烟碱含量对其向降烟碱转化程度的影响

在烟株生长早期鉴别转化株,需要对转化株的烟碱转化进行诱导以使转化性状充分表达,但同一基因型材料在不同生长条件下经诱导产生的烟碱转化程度存在较大差异。本试验旨在探讨转化株的烟碱基础含量对诱导后烟碱转化程度的影响。结果表明由于打顶和增施氮肥造成烟碱基础含量增高可显著降低诱导后的烟碱转化程度。在温室条件下,通过调节氮肥施用量获得具有不同烟碱含量的植株,以白肋烟TN90的高转化品系为材料的试验表明,当烟碱基础含量超过2.0%时,烟碱向降烟碱转化不完全,随着烟碱含量的增高,烟碱转化百分率几乎呈线形下降。采用由高转化系和非转化系杂交的F1植株为材料进行试验,发现烟碱转化百分率随烟碱含量下降的趋势更加明显。采用低转化株的自交分离后代进行试验,发现在低施氮水平下对转化株进行诱导和鉴别的有效性高于在高施氮条件下对转化株的诱导和鉴别。因此,使烟株维持较低的烟碱水平有利于转化株特别是低转化株的有效鉴别。      

烟碱向降烟碱转化对烟叶麦斯明和TSNA含量的影响

以白肋烟TN90为材料,研究了非转化株、低转化株及高转化株烟叶样品的烟碱转化程度及降烟碱含量与烟叶麦斯明和烟草特有亚硝胺(TSNA)含量的关系。结果表明,随着烟株烟碱转化能力的提高和烟叶降烟碱含量的增加,叶片和主脉的麦斯明含量呈线性增加。当烟碱转化率超过20％时,麦斯明含量超过了假木贼碱的含量。在4种主要的TSNA中,具有不同烟碱转化能力的样品间4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)含量没有显著差异,N-亚硝基降烟碱(NNN)含量则随着烟碱转化能力的提高和降烟碱含量的增加而大幅度升高,尤其在主脉中表现更为明显。NNN占总TSNA的比例随烟碱转化程度的提高而增加,在高转化烟株中可高达90％,其它3种TSNA占总TSNA的比例相应降低。叶片中NAT含量和比例一般高于NNK,而在主脉中NNK含量高于NAT。     

硃砂烟CYP82E4基因表达模式及烟碱转化率分析

为解析硃砂烟基本特征特性, 以“硃砂2号”为研究材料, 调查其田间农艺性状及硃砂烟叶产出规律, 通过qPCR分析CYP82E4基因表达模式, 并检测硃砂烟叶生物碱含量。结果表明, 硃砂2号农艺性状与云烟87无显著差异, 烤后硃砂烟叶比率随着叶位增高逐步上升。硃砂2号烟叶中CYP82E4基因高水平表达, 导致大量烟碱被转化生成去甲基烟碱, 浅红、中等红色、深红三种类型硃砂烟叶的烟碱转化率分别为86.95%、90.86%、93.85%, 远高于云烟87的5.12%。硃砂烟子代植株中CYP82E4基因高表达、高烟碱转化率性状能够稳定遗传, 烤后烟叶均呈现明显的硃砂烟外观特征。本研究揭示了硃砂烟基本特征特性, 为进一步研究硃砂烟的成因及化学特性提供理论支撑。      

烟碱生物合成分子机制的研究进展

烟碱是烟草主要的生物碱,其生物合成受烟株生长时期、激素水平、生物和非生物胁迫等诸多因素的调控。从烟碱生物合成途径及相关酶、参与烟碱合成的调控因素、用于解析烟碱生物合成相关基因的方法等方面,综述了有关烟碱生物合成代谢的分子机制及其调控的研究进展,旨在为烟碱生物合成的基因调控、代谢工程提供参考。     

降烟碱细菌-烟草节杆菌K9的分离及鉴定

采用烟碱为唯一碳源的选择性培养基,对烟草、植烟土壤及烟草污水中的细菌进行选择性分离,共分离得到97株能够分解利用烟碱的细菌,其中菌株K9分解能力最强。经生理生化分析以及16SrDNA序列同源性分析,鉴定为烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)。为微生物降烟碱的研究及应用提供了理论依据。     

烟草中烟碱的高效液相色谱分析综述

综述了烟草及烟草制品中烟碱的高效液相色谱分析的研究现状、反相和离子对HPLC色谱模式、样品提取与辅助技术和纯化等,认为应加强有关建立快捷、稳定、对环境友好的处理大量样品的制备方法研究。     

烟草中游离烟碱与其pH值之间的关系

研究了烟草中游离烟碱的萃取条件 ,确定了采用水、三氯甲烷依次萃取和气相色谱分析烟草中游离烟碱含量的方法 ,烟碱的回收率为 95 .1%～ 99.8% ,方法的RSD为 1.2 1%～ 1.70 %。同时 ,还考察了烟草总烟碱及其pH值测定方法的准确性 ,采用这些方法测定了 4 7种商品卷烟的游离烟碱、总烟碱和pH值 ,并进行了相关分析。结果表明 ,游离烟碱、游离烟碱与总烟碱的比值和pH值都呈显著的正相关关系 ,游离烟碱和总烟碱、总烟碱和pH值均无相关性     

烟碱去甲基化酶基因功能阻断是一种有效和实用的降低烟草去甲基烟碱水平的方法

阻断烟草中去甲基烟碱的形成可以降低一种在烟叶调制过程中经亚硝化形成的TSNA——N’-亚硝基-去甲基烟碱（NNN）的含量。在之前的研究中，我们报道了烟碱去甲基化酶基因的发现及其使用GMO（转基因生物，RNAi干扰方法）和非GMO（诱变）策略降低烟碱去甲基酶活性。本研究报道了在高代和育成品系中这种策略的有效性和稳定性，并且描述了将RNAi和突变位点成功转入不同品种的育种过程和进展。在多重试验中实验材料种植在大田环境下，包括4代RNAi转基因系和相应的R2代雄性不育系副本。     

降解烟碱微生物的筛选及其酶在烟草中的应用

从昆明卷烟厂附近的土壤中筛选出一株具有高效降解烟碱能力的细菌。该细菌在以烟碱为惟一的碳源和氮源的培养基中能生长良好,在液体培养基中培养(发酵)78h,培养基中的烟碱分解80%以上,且发酵期间培养液呈现颜色变化:无色、蓝色、深蓝色、黑色和褐色。根据生态特征和生理生化分析结果,初步鉴定该菌为节细菌属。在100g烟丝中分别加入2mL该菌酶液(酶蛋白浓度10.15mg/mL)和菌液(109个/mL),各培养2和7d,其烟碱降低了15.2%和22.1%。     

烟碱转化率与卷烟感官评吸品质和烟气TSNA含量的关系

用具有不同烟碱向降烟碱转化能力的白肋烟鄂烟一号上部叶(2003年)和中部叶(2004年)分别卷制试验卷烟,研究了烟碱转化率与卷烟感官评吸品质和烟丝及烟气中TSNA含量的关系。同一年份的卷烟样品间总生物碱含量无显著差异,烟碱含量和降烟碱含量呈相反趋势变化,从而形成样品间烟碱转化率的梯度差异。感官评吸由5-6名评吸专家组成的评吸小组进行。结果表明,随着烟碱转化率的增高,白肋烟风格程度直线下降,香气质逐渐下降,香气量减少,烟气浓度变淡,生理强度下降,杂气有增加的趋势,余味变劣,口腔残余加重,但刺激性有减小的趋势。两年卷烟样品基本表现相同的趋势,但2003年样品,由于生物碱水平高,不同样品间烟碱转化率的幅度较大,所以各项评吸指标的变化更为明显。随着烟碱转化水平的增高,烟丝和烟气亚硝基降烟碱(NNN)含量和总的烟草特有亚硝胺(TSNA)含量大幅增加,而其它3种烟草特有亚硝胺含量无较大变化。      

我国不同类型烟叶烟碱转化株的比例和转化程度分布

为进一步纯化烟叶群体,提高烟叶品质。对我国5种类型(烤烟、白肋烟、香料烟、马里兰烟和晒红烟)13个主栽品种的烟叶(2003-2004年调制)烟碱转化株的比例和转化程度分布进行了分析测定。白肋烟品种和杂交种存在严重的烟碱向降烟碱转化问题,总转化株占烟株群体的比例除B37外,均在30%以上;烤烟品种烟碱转化问题相对较小,转化株比例低,且多为低转化株,所测品种群体中总转化株的比例不超过7%;香料烟和马里兰烟群体总转化株比例也偏高,分别为10.0%和9.84%,而且有一定比例的高转化株;晒红烟转化株比例较低。      

烟草中绿原酸、烟碱和茄尼醇的超声波辅助提取

考察了烟草中绿原酸、烟碱和茄尼醇的超声波辅助提取,结果表明:最佳工艺条件为:pH4的95%乙醇作溶剂,料液比1∶15,80℃提取两次,每次45min。在此条件下,绿原酸、烟碱和茄尼醇的提取率分别为93.65%、95.42%和82.35%,而热回流法这3种成分的提取率各为85.56%、84.79%和73.54%。     

基于烟茄嫁接的低烟碱烟草烟叶化学成分变化

为探索通过嫁接技术有效降低烟叶烟碱含量的技术,以茄子为砧木,云烟87为接穗,采用盆栽试验研究了烟茄嫁接生产低烟碱烟叶的可行性和烟叶化学成分的变化。试验共设烟/烟、烟/茄不培土、烟/茄培土等3个处理。结果表明:烟茄嫁接,烟株植物学特征和农艺性状未显著改变,烟叶烟碱含量降至极低水平,鲜烟叶中烟碱含量低至0.08%,烤后烟烟叶烟碱含量低至0.10%,比对照降低95%,假木贼碱和降烟碱含量也有所降低,但假木贼碱的下降比例较小,表明假木贼碱在叶片中有一定的合成能力,新烟草碱在鲜烟叶和烤后烟中均未检测到。在接穗底部培土诱发了不定根产生,能够促进生物碱的合成,导致烟/茄培土的烟碱含量比烟/茄不培土明显升高;烟茄嫁接的烟叶叶绿素含量显著高于对照,成熟较慢,蛋白质、淀粉、总氮含量较高,总糖、还原糖含量降低。本研究为通过农业措施选择性降低和调节烟叶烟碱含量提供了新的途径。      

白肋烟杂交种及亲本烟碱转化株的鉴别

对我国白肋烟主栽杂交种鄂烟一号和9803调制后烟叶的生物碱组成和含量进行了定株测定,发现存在严重的烟碱向降烟碱转化问题,其中种植历史较长的鄂烟一号的总转化株比例和高转化株比例分别为43.4%和24.5%,都高于新选育的9803。通过对鄂烟一号亲本材料转化株的早期诱导和鉴定,发现作为母本的B21不育系和作为不育系保持系的正常可育的B21群体中都含有极高比例的转化株,分别为81.3%和70.7%,而作为父本的B37转化株较少,为10.9%。因此鄂烟一号的高转化株比例主要由母本引起。对杂交种9803亲本转化株的鉴别结果表明,母本TN86不育系和父本B21低生物碱品系的总转化株占群体的比例分别为40.5%和23.3%,母本对杂交种转化基因的贡献大于父本。      

N-亚硝基降烟碱代谢途径及检测方法的研究进展

介绍N-亚硝基降烟碱(NNN)在动物体内、外的代谢途径,并列举NNN及其代谢物检测方法的相关研究,为寻找降低NNN致癌性的方法提供科学依据。     

晾制湿度对白肋烟烟碱向降烟碱转化的影响

通过控制烟叶在变黄-褐变期的晾制湿度,研究了晾制过程中湿度对白肋烟中烟碱向降烟碱转化的影响.结果表明,不同晾制湿度下高转化株主脉的烟碱转化率均高于叶片,非转化株除低湿处理B21的第15叶位外,其余处理烟碱转化率表现出与高转化株相同的趋势.高转化株叶片烟碱含量在低湿处理时最高,非转化株叶片烟碱与降烟碱含量皆因品种与叶位的不同而存在差异.无论是高转化株还是非转化株,较低的晾制湿度均有利于降低叶片的烟碱转化率;晾制湿度对烟叶主脉中烟碱、降烟碱及烟碱转化率的影响,因试验品种的不同而异.因此,晾制过程中及时降低晾制湿度有利于降低烟叶的降烟碱含量.     

NtJAZ1基因敲除对烟草MeJA应答反应的影响研究

【目的】探究NtJAZ1敲除对烟草响应外源茉莉酮酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）对生长发育、腺毛发生、烟碱生物合成的应答反应的影响。【方法】以野生型K326为对照,比较不同浓度MeJA处理下,NtJAZ1敲除的K326突变品系NK-9在种子萌发、根系发育、腺毛形态、烟碱生物合成等方面的差异。【结果】（1）MeJA处理显著抑制了种子的萌发,在100μmol/L MeJA处理条件下,K326的种子萌发率比未经MeJA处理的种子萌发率降低了85.72%,NK-9的种子萌发率比未经MeJA处理的降低了48.12%。（2）MeJA处理抑制根系发育,在300μmol/L MeJA处理条件下,K326幼苗主根比未经处理的缩短了83.33%,NK-9幼苗主根缩短了68.18%。（3）Me JA处理诱导腺毛发生,在5 mmol/L MeJA处理条件下,K326叶面长柄腺毛密度比未经处理的提高了42.55%,NK-9提高了21.05%。（4）MeJA处理促进烟碱生物合成,在5 mmol/L MeJA处理条件下,K326烟苗的烟碱含量比未经处理的提高了76.05%,NK-9提高了37....     

NtCycB2和NtJAZ1共敲除对烟草腺毛密度和烟碱含量的影响

为了提高烟草的腺毛密度、腺毛分泌物和烟碱含量,从而改善烟株抗性和烟叶品质,以NtCycB2突变的多腺毛K326突变株系（hairy K326）为材料,采用CRISPR/Cas9技术对NtJAZ1进行基因编辑,筛选出NtCycB2与NtJAZ1基因共敲除的纯合株系J-21,并以K326和hairy K326为对照,对J-21的农艺性状、腺毛发育、烟碱生物合成和烟叶化学成分进行了研究。结果表明,J-21植株生长发育正常,主要农艺性状与K326和hairy K326无显著差异,其叶片腺毛密度比hairy K326有所降低,但比K326显著提高,腺毛分泌物含量（质量分数）提高156.35%。J-21叶片烟碱含量在现蕾期比K326和hairy K326显著提高,在烟株打顶后提高幅度明显降低,成熟期叶片烟碱含量比K326和hairy K326分别提高37.14%和32.28%。J-21烤后烟叶化学成分协调,烟碱含量比K326和hairy K326分别提高39.81%和45.32%,西柏烷类降解产物茄酮含量比K326和hairy K326分别提高217.49%和48.45%。表明NtCycB2和Nt...     

嵌合体植株对白肋烟内的烟碱向降烟碱转换稳定性的作用

烟草（Nicotiana tabacum L．）中现有的可将烟碱转化为降烟碱的转化株都不够理想。目前的认知水平对这一特性在白肋烟中的表现也知之甚少。研究就非稳定植株的遗传特性对其后代的影响进行了评估，并对可能造成这种遗传非稳定性的原因进行了探讨。