揄干离褶伞菌丝体溶栓酶特性研究

探讨各种因子对榆干离褶伞溶栓酶活性的影响,观察溶栓酶对纤维蛋白及纤维蛋白原的水解特征和酰胺水解活性.实验结果表明,该酶的最适pH为6,最适温度为35℃,并对tPA底物S-2288最敏感.Mn2 和Mg2 激活酶活性,而Cu2 、EDTA对酶活有抑制作用.该酶不仅直接水解纤维蛋白,还可以水解纤维蛋白原.因此,榆干离褶伞溶栓酶很有可能成为治疗和预防血栓栓塞性疾病的新来源.     

白黄侧耳溶栓酶的分离纯化及特性分析

采用离子交换层析、凝胶过滤层析及快速蛋白液相色谱等蛋白质分离纯化技术,从白黄侧耳菌丝体中纯化一种溶栓酶,并进行酶学性质研究。实验结果表明,其分子质量约为18 ku,该酶的最适pH和最适温度为pH 7.0,40℃,并对糜蛋白酶底物S-2586最敏感。Co2+和Mg2+激活该酶活性,而Cu2+、EDTA对酶活有抑制作用。该酶不仅可直接水解纤维蛋白,还可以水解纤维蛋白原。     

榆干离褶伞菌丝体中溶栓酶的分离纯化

采用离子交换层析、凝胶过滤层析及快速蛋白液相色谱等蛋白质分离纯化技术,从榆干离褶伞菌丝体中分离纯化了一种溶栓酶。实验结果表明,其分子量约为50ku,比活性为750.6Unit/mg,活性得率为12.5%。榆干离褶伞很有潜力成为治疗血栓的新的药物来源。     

榆干离褶伞溶栓酶对内皮细胞损伤大鼠模型的保护作用

目的探讨榆干离褶伞溶栓酶对肾上腺素致血管内皮细胞损伤的保护作用。方法采用注射肾上腺素结合冰浴的方法制备大鼠血管内皮细胞损伤模型,检测血液循环内皮细胞数(CEC)和血浆血栓素B_2(TXB_2)、6-酮-前列腺素E_(1α)(6-keto-PGE_(1α))、组织纤溶酶原激活物(t-PA)以及抗凝酶Ⅲ(AT-Ⅲ)的含量。结果模型组的CEC和TXB_2水平较正常组明显增高,且t-PA和AT-Ⅲ含量下降。用药组可减少CEC和TXB_2水平,提高6-keto-PGE_(1α)、t-PA和AT-Ⅲ含量。结论榆干离褶伞溶栓酶对血管内皮细胞起保护作用。     

榆干离褶伞发酵液体外抗氧化性能研究

目的:研究榆干离褶伞发酵液的体外抗氧化作用。方法:利用比色法测定榆干离褶伞发酵液对羟基自由基.OH、H2O2、二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)的清除能力和红细胞自氧化溶血的影响以及H2O2诱导的肝损伤组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)的活性和丙二醛(MDA)的含量。结果:榆干离褶伞发酵液具有清除.OH、H2O2和DPPH自由基能力,降低红细胞溶血率,提高肝组织SOD、GSH-Px、CAT活性并抑制肝组织MDA的生成。结论:榆干离褶伞发酵液具有体外抗氧化作用。     

榆干离褶伞发酵液对急性肝损伤的保护作用

目的:研究榆干离褶伞发酵液对四氯化碳(CCl4)诱发的急性肝损伤的保护作用。方法:用CCl4建立小鼠急性化学性肝损伤模型,检测榆干离褶伞发酵液对血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性以及肝组织白蛋白(Alb)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力和丙二醛(MDA)的含量。结果:榆干离褶伞发酵液明显降低急性肝损伤小鼠血清ALT活性,提高SOD、GSH-Px活力及Alb含量并显著降低MDA含量。结论:研究榆干离褶伞发酵液具有一定的肝保护作用,其机制可能与其抗氧化作用有关。     

榆干离褶伞溶栓酶对大鼠动脉血栓的抑制作用

目的:研究榆干离褶伞溶栓酶(Lyophyllum ulmarium fibrinolytic enzyme,LUFE)对大鼠动脉血栓形成的抑制作用及其机制.方法:将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组和LUFE低、高剂量组,除假手术组以外,其余4组均以三氯化铁建立颈动脉血栓模型.造模前阳性对照组和LUFE低、高...     

苦瓜核糖核酸酶的分离纯化与性质分析

目的:分离纯化苦瓜核糖核酸酶,并进行酶学性质及生物学性质研究,为其生物活性蛋白研究提供依据。方法:采用乙醇沉降、C_(18)反相高效液相色谱、Tricine-SDS-PAGE和等电聚焦等方法分离纯化与鉴定,以酵母tRNA为底物测定核糖核酸酶酶活性。结果 :从苦瓜中分离纯化获得一种核糖核酸酶,命名为MC-RNase。Tricine-SDS-PAGE和C18反相液相色谱鉴定表明该酶具有较高纯度。其N-端氨基酸序列为VNEFDYYQVVLQWQPAT,相对分子质量为14 ku,等电点PI值为8.1;酶学性质表明,该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5,金属离子Zn~(2+)、Fe~(2+)、Fe~(3+)、Mg~(2+)对该酶均有抑制作用,而Pb~(2+)可以增强该酶活性;细胞试验结果表明,该酶对人正常细胞L-02及肝癌细胞Hep-G2并没有明显的抑制作用。结论:从新鲜苦瓜组织中分离并鉴定出一种新的核糖核酸酶。     

玉米皮纤维发酵裂褶菌的产酶分析及木聚糖酶基因克隆、表达和酶学性质测定

以玉米皮为唯一碳源培养裂褶菌,分别测定发酵液中半纤维素酶活性,结果显示木聚糖酶酶活为7.45U/mL、乙酰木聚糖酯酶酶活为3.41 U/mL、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸苷酶活相对较低,分别为0.44 U/mL和0.074 U/mL。根据酶活测定结果克隆了裂褶菌的木聚糖酶基因Xyn22,完成了该基因在大肠杆菌中的表达、重组蛋白纯化和性质研究。Xyn22的最适反应温度为40℃,当反应温度在45℃时其相对酶活在80%以上。Xyn22的最适pH为5.0,在4.5~6.5的范围内酶活均在80%左右。Xyn22在pH 3.0~10.5范围内较稳定,酶活保持在80%左右。Mg~(2+)、Ba~(2+)、EDTA和Hg~(2+)对酶活有很大的抑制作用,Hg~(2+)可以使Xyn22几乎完全失活。     

鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

试验研究皱纹盘鲍内脏中β-葡萄糖苷酶的分离纯化技术,以及pH、温度及金属离子和某些抑制剂对β-葡萄糖苷酶活性的影响。结果表明,以硫酸铵分级盐析鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶,选取30%饱和度的硫酸铵初步盐析除杂,80%饱和度的硫酸铵沉淀,能使鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶的初步纯化效果最佳;经SDS-PAGE分析,透析后的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶纯度较高,分子量约为54.0~76.0 k Da;β-葡萄糖苷酶的最适温度为50℃,最适pH为3.5,在小于50℃、pH 3.0~6.0下均能保持稳定;Zn~(2+)、Cu~(2+)和Ag+对鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶活性有明显的抑制作用;Na~+、K~+、Mg~(2+)、Ca~(2+)和Fe~(2+)对酶活性影响不明显;Ba~(2+)、EDTA和Mn~(2+)对酶活均有激活作用,其中,Mn~(2+)激活作用最强。以p-NPG为底物,β-葡萄糖苷酶动力学常数Km为4.66 mmol/L,Vmax为3.79 U/L。     

榆干离褶伞溶栓酶对血栓模型大鼠血小板活性的影响

目的:研究榆干离褶伞（Lyophyllum ulmarium,L.u）溶栓酶的抗血栓作用及对血小板活性的影响。方法:三氯化铁诱导大鼠颈动脉血栓模型,检测血栓重量,用流式细胞仪检测CD62P的表达,酶联免疫吸附法测定p-选择素、血管性血友病因子（v WF）、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa、血栓素B2（TXB2）和6-酮-前列腺素E1α（6-keto-PGE1α）的水平。结果:与模型组相比,L.u溶栓酶处理以后大鼠血栓重量明显减轻,CD62P阳性率、p-选择素、v WF、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa以及TXB2的含量不同程度地下降,对6-keto-PGE1α的影响不显著。结论:L.u溶栓酶具有抗血栓作用,其机制可能与抑制血小板的活化作用有关。      

榆干离褶伞溶栓酶对氧化应激损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用

目的：探讨榆干离褶伞（Lyophyllum ulmarium,L.u）溶栓酶对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞（humanumbilical vein endothelial cell,HUVEC）损伤的保护作用。方法：用H2O2诱导HUVEC氧化损伤,采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法观察细胞存活率;用流式细胞仪检测细胞线粒体跨膜电位（ΔΨm）和总活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;Western blotting法检测Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3等蛋白的表达水平。结果：L.u溶栓酶可显著提高HUVEC的存活率,明显抑制H2O2诱导的细胞内ROS生成和线粒体跨膜电位的下降,并能降低Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的表达水平。结论：L.u溶栓酶对氧化应激损伤的HUVEC有保护作用,其机制可能与抑制细胞凋亡有关。     

榆干离褶伞发酵液的溶栓与降血脂作用

研究了榆干离褶伞(Lyophyllum ulmarium,L.u)发酵液的体外溶栓作用和降血脂作用。将血凝块与L.u发酵液37℃恒温孵育,测定血凝块溶解时间;观察给予L.u发酵液后对小鼠体内出、凝血时间的影响;采用高脂血症动物模型,观察L.u发酵液对血脂水平的影响。结果显示,L.u发酵液明显延长凝血时间及出血时间,明显降低高脂血症小鼠总甘油三酯和总胆固醇含量。可以证明,L.u发酵液具有溶栓作用,其机制可能与其抗凝作用和降血脂作用有关。     

榆干离褶伞溶栓酶对脂多糖诱导的大鼠炎性肝损伤的保护作用

本实验研究榆干离褶伞溶栓酶(Lyophyllum ulmarium fibrinolytic enzyme,LUFE)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肝损伤的保护作用,并初步探讨其作用机制。将大鼠随机分为五组,分别为对照组、模型组、阳性对照组、LUFE低剂量组、LUFE高剂量组。LUFE分别以200、400 mg/kg体质量灌胃2周。除对照组以外其余四组均以腹腔注射LPS诱导大鼠肝脏炎性损伤模型。阳性对照组在造模前腹腔注射地塞米松(5 mg/kg)。苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理改变;检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(ALB)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平;Western bolt方法观察肝组织Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)、p-TAK1和p-NF-κB p65蛋白水平。实验结果表明,LUFE可缓解LPS诱导的肝组织的炎性损伤,降低血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量和AST、ALT活性,提高ALB水平。Western bolt结果显示,LUFE下调TLR4、p-TAK1、p-NF-κBp65蛋白水平。以上结果表明LUFE抑制肝脏炎性损伤,其机制可能与其下调TLR4-NF-κB通路相关蛋白的表达有关。     

解淀粉芽孢杆菌产纤溶酶的19 L发酵罐实验及其酶学性质

在摇瓶实验的基础上,对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZJSI-12-7产纤溶酶最佳条件进行19 L发酵罐实验,结果表明：GZJSI-12-7在发酵罐中培养6 h时开始产纤溶酶,78 h后纤溶酶产量基本稳定,达到4 178.39 IU/mL,产酶高峰比摇瓶发酵提前12 h左右。将发酵液经离心除菌、硫酸铵分级盐析、透析除盐、SephadexG-75凝胶过滤,得到纤溶酶的纯化倍数为9.84 倍,酶活力回收率为42.52%,比活力为48 073.193 IU/mg。对纤溶酶的酶学性质研究表明,该酶的分子质量约为30.2 kD,最适温度和pH值分别为40 ℃、7.5;在40 ℃以下酶的稳定性良好,超过50 ℃后酶活力迅速降低,耐热性较差;金属离子Mg2+、Ca2+、Mn2+对纤溶酶活性均有较强的激活作用,而Cu2+和Fe3+对酶活性具有明显的抑制作用。     

淡豆豉纤溶酶的分离纯化

淡豆豉浸提液经过硫酸铵沉淀、CM-Sepharose-FF离子交换色谱和Sephacryl S-200凝胶过滤等步骤，得到豆豉纤溶酶，经SDS-PAGE表明豆豉纤溶酶为单一谱带。推断DCFE没有亚基，以单体形式存在。经过纯化，豆豉纤溶酶的回收率为3．7％，纯化倍数35．5倍，比活达到10898IU／mg。SDS-PAGE凝胶电泳和Sephacryl S-200凝胶过滤测定的DCFE相对分子质量分别为30．2kDa和31．OkDa，两种方法测定的分子量相近，说明该酶为单体酶。     

榆干离褶伞溶栓酶对酒精诱导大鼠肝损伤的保护作用

目的：研究榆干离褶伞溶栓酶（Lyophyllum ulmarium fibrinolytic enzyme，LUFE）对酒精诱导大鼠肝损伤的保护作用。方法：将大鼠随机分为4 组，即正常对照组，模型组，LUFE低、高剂量组。除正常对照组以外，其余各组每日按10 mL/kg mb灌胃体积分数40%的酒精诱导肝损伤。LUFE低、高剂量组分别以100、400 mg/kg mb的剂量灌胃LUFE，正常对照组和模型组以等量生理盐水灌胃，共28 d。末次给药后次日处死大鼠，苏木精-伊红染色观察大鼠肝组织病理形态学变化，检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、清蛋白（albumin，Alb）、γ-谷氨酰转移酶（γ-glutamyltranspeptidase，γ-GT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总胆红素（total bilirubin，T-BIL)、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，T-CHO）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。蛋白免疫印迹法检测抑制性-κBα（inhibitory kappa B-alpha，I-κBα）蛋白表达水平和核转录因子（nuclear factor，NF）-κB p65磷酸化（p-NF-κB）水平。结果：LUFE干预能减轻肝组织的病理性损伤，抑制酒精所致的血清AST、ALT、γ-GT、ALP活力及TG、T-CHO、LDL-C、T-BIL水平的升高和Alb水平的降低，其中高剂量LUFE能达到显著抑制效果（P＜0.05，P＜0.01）。Western blot结果表明，与模型组相比，LUFE干预能提高I-κBα蛋白表达水平，抑制NF-κB p65蛋白的磷酸化，其中高剂量LUFE能达到显著改善效果（P＜0.05，P＜0.01）。结论：LUFE对酒精所致大鼠肝损伤有保护作用，其机制可能与其抗氧化、抗炎作用有关。