Thermoanaerobacter sp. X514嗜热脂肪酶LipTX的异源表达与酶学性质研究

本文克隆表达了来源于嗜热细菌Thermoanaerobacter sp.X514的嗜热脂肪酶Lip TX基因(Teth514_0029),利用亲和层析纯化了脂肪酶Lip TX,并详细研究了该脂肪酶的酶学性质。采用PCR技术扩增脂肪酶Lip TX基因,克隆到载体p ET15b中,构建重组载体p ET15b-Lip TX;将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中并利用IPTG诱导表达目的蛋白,经70℃热处理和Ni-NTA亲和层析两步纯化,得到纯化的重组酶。SDS-PAGE结果表明,脂肪酶Lip TX分子量为28 ku。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度和pH分别为70℃和7.5;通过水解底物特异性和动力学实验,发现LipTX可以水解不同长链酰基(C_8-C_(12))的对硝基苯酚酯底物,对硝基苯酚癸酸酯是该酶最适合底物;同时该酶能够水解链长在C_4到C_(16)范围的三甘油酯底物,其中以甘油三丁酸酯为底物的酶活力最高。该酶对非极性有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、DMF、DMSO和正己烷和氯仿)和变性剂(SDS、Tween-20和Triton X-100)具有较强的抗性,因此在生物催化和有机化学合成中具有广阔的开发应用前景。     

传统食品发酵环境宏基因组中酯酶基因的克隆、表达及性质分析

微生物酯酶是一种广泛应用于食品、医药和精细化工等领域的工业化酶。为了丰富酯酶资源,本文通过提取我国传统发酵食品环境样品总基因组DNA,构建宏基因组文库,从中筛选获得一个新的酯酶基因(est_115),该基因全长948 bp,编码316个氨基酸,其蛋白序列同源性分析,表明与来自Pseudomonas lutea的羧酸酯水解酶同源性最高为38%,显示酯酶Est_115属于新的酯酶类。然后构建了est_115基因重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,经纯化得到重组酯酶Est_115。酶学性质的分析表明,该重组酯酶Est_115对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯具有较高的催化活性,最适作用温度为35℃,最适p H值为7.0,在10%~18%Na Cl条件下,酶蛋白可保持较高的催化活性,具有良好的耐盐性,提示该酶可以应用在高渗透压食品加工中,是一个新型的极具潜力的酯酶。     

阿魏酸酯酶活性的分光光度法测定及影响因素研究

分别以去淀粉麦麸和对硝基苯酚阿魏酸酯为底物,研究了紫外-可见光分光光度法测定阿魏酸酯酶酶活的方法,通过测定阿魏酸的释放量和对硝基苯酚的释放量来计算阿魏酸酯酶的活力,并研究了酶活测定的影响因素.同时,对去淀粉麦麸分光光度法测定酶活进行了方法学验证,得到平均回收率达99.86％,RSD值为0.65％.并将此方法与对硝基苯酚阿魏酸酯分光光度计法及HPLC法测定阿魏酸酯酶酶活进行了比较,结果表明去淀粉麦麸分光光度计法测定阿魏酸酯酶酶活具有稳定性好,相对偏差较小的优点且简便可行.     

鼠李糖乳杆菌LGG芳香酯酶的酶学表征与结构分析

为获得新型益生菌酯酶资源,通过挖掘鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus GG,LGG）的基因组信息,对芳香酯酶LggAE进行基因克隆、表达纯化、酶学表征与结构分析。结果表明：LggAE的最适反应pH值为7.5,在pH 7.0～10.0范围内保持75%以上酶活力,最适反应温度为50℃,偏好水解中链对硝基苯酚酯,最适底物为对硝基苯酚辛酸酯,在40℃条件下具有一定热稳定性,乙二醇可提升LggAE 17.3%酶活力,LggAE耐受二甲基亚砜,在较高盐浓度柠檬酸钠和氯化钠存在下能保持39.1%～71.0%酶活力,脱氧胆酸钠在高温下显著抑制酶活力。结构分析显示LggAE的底物结合口袋呈较小孔洞状,主要由脂肪族氨基酸残基构成。     

Burkholderia sp.JXJ-16低温耐有机溶剂脂肪酶产酶条件优化及粗酶酶学性质

以Burkholderia sp.JXJ-16为出发菌株,对其低温耐有机溶剂脂肪酶的产酶条件进行单因素实验并研究其粗酶酶学性质。该菌株的最佳产酶条件为:蔗糖3.75 g/L、尿素11.25 g/L、K_2HPO_42 g/L、(NH4)2SO_41 g/L、Mn SO_40.25 g/L、猪油乳化液体积分数2.5%,初始p H9.0、培养温度30℃、装样量20 m L/250 m L、接种量3%、发酵时间20 h。JXJ-16脂肪酶粗酶对中链对硝基苯酚酯有最大水解活力,最适底物为对硝基苯酚辛酸酯;该粗酶在35℃、p H8.5~9.0时酶活力最高,且具有较好的温度(30~60℃)和p H(5.0~10.5)稳定性;Na~+、Mg~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)、EDTA对粗酶活力具有激活作用,Zn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)对粗酶活力具有抑制作用,K~+对粗酶活力没有显著性影响;除乙醇和乙腈外,该粗酶在一定体积分数的异丙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、二甲苯和正己烷中具有良好耐受性,且处于激活状态。综上,该菌株能利用廉价易得的培养基原料达到最佳产酶效果,其所产脂肪酶为低温碱性脂肪酶,具有较好的温度和p H稳定性,对多数供试有机溶剂具有良好耐受性。     

麦芽中脂肪酶活性检测及酶学性质的研究

以乙酸对硝基苯酚酯(p-NPA)为底物,采用对硝基苯酚法测定了麦芽中脂肪酶的活性,并对其酶学性质进行了研究.实验结果表明,麦芽中脂肪酶的最适反应pH为8.5,与5mmol/L的p-NPA的最适反应体积比为1∶7,金属离子Mg2+对麦芽脂肪酶活性有显著的抑制作用,Fe3+、K+则有一定激活作用;该酶热稳定性较强,40℃水浴保温120min,其酶活性几乎保持不变,70℃保温120min后接近失活.麦芽脂肪酶对p-NPA的酶动力学常数Km为0.13mmol/L,Vm值为0.016mg/min.     

产脂肪酶极端丝状真菌的筛选及其酶学特性

从南非德班市及其周边地区采集的76个土样中筛选得到99株嗜碱丝状真菌和51株嗜热丝状真菌,利用橄榄油乳化法以及对硝基苯酚法筛选得到三株具有底物专一性的菌株F4-173、F4-262、F8-67,经ITS分子生物学鉴定方法分别鉴定为Aspergillus fumigatus、Penicillium verrucosum、Penicillium chrysogenum。其中,Aspergillus fumigates F4-173可专一性分解菜籽油,其最适作用条件40℃、p H8.0,Penicillium verrucosum F4-262可专一性分解对硝基苯酚月桂酸酯,其最适作用条件为40℃、p H8.0,Penicillium chrysogenum F8-67可专一性分解大豆油,其酶液最适作用条件为50℃、p H6.5。     

黑曲霉脂肪酶CutA的芳香酯合成活性

芳香酯是食品、饮料和护理品中重要的风味成分。通过分子克隆、表达与酶学特征解析,从黑曲霉F0215中鉴定出一种新的、具有催化合成芳香酯活性的脂肪酶Cut A。该酶在30℃和p H 7. 0时呈现最高活性,以对硝基苯酚乙酸酯为底物的K_m和V_(max)值分别为19. 5 mmo L/L和63. 3 mmol/(m L·h)。在30℃、有机溶剂介导条件下,Cut A催化丁酸和丁醇、乳酸和乙醇、辛酸和乙醇生成丁酸丁酯、乳酸乙酯或辛酸乙酯,转化率分别为17. 2%、4. 7%和1. 8%。脂肪酶Cut A可用于发酵食品的风味生成与改善。     

南海深海链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 13580脂肪酶的酶学性质

对从南海深海链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 13580中的新颖脂肪酶L-1进行了酶学性质鉴定。脂肪酶L-1对对硝基苯酚己酸酯的催化活性最高,最适反应温度为40℃,最适反应p H为8.0,在最适条件下的酶活力为51.5 U/mg。脂肪酶L-1对大部分有机溶剂和表面活性剂具有极好的耐受性。同时该南海深海微生物脂肪酶能在温和条件下催化制备多种短链酯食品香料产品,具有较好的工业应用前景。     

凝结芽孢杆菌RY237 β-半乳糖苷酶酶学性质研究

为研究乳品中具有应用价值的乳糖酶,以乳糖为唯一碳源,用邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)法,从产乳酸的细菌中筛选出了产乳糖酶活力高的菌株RY237,其活性达4.98 U/m L,鉴定为凝结芽孢杆菌。研究了乳糖酶的酶学性质,该酶最适反应温度和最适p H分别为50℃和6.0。该酶在温度40~50℃具有良好的稳定性;p H5.5~8.0表现稳定,p H7.0出现酶活峰值。金属离子Ca~(2+)、K+、Zn~(2+)、Mn~(2+)、Na+、Mg~(2+)对酶活具有抑制作用,Cu~(2+)对酶活具有完全抑制作用,EDTA对酶活具有激活作用。凝结芽孢杆菌RY237乳糖酶活性高、性能优良,具有应用价值。