毕赤酵母不同甲醇利用表型Mut+和Muts表达FsGLUm基因的比较

将来源于产琥珀酸丝状杆菌的β-葡聚糖酶基因根据毕赤酵母的偏好性进行密码子优化,通过全基因合成该优化基因（Fs GLUm）并构建重组表达载体p PIC9K-Fs GLUm。将p PIC9K-Fs GLUm分别用SalⅠ和BglⅡ酶切线性化后电击转化入毕赤酵母GS115染色体DNA中,经过表型筛选和抗性筛选获得不同甲醇利用表型Mut+和Muts阳性菌株。经刚果红平板检测,在摇瓶水平下,Mut+型菌株表达产物产生的水解透明圈明显大于Muts型菌株表达产物。在发酵罐水平下,Mut+型菌株各时间段表达产物酶活性明显高于Muts型菌株。Mut+型菌株表达的酶活性在甲醇诱导96h达到最大值,为6424U/m L,比活性为2607U/mg,菌体干重为123.6g/L。Muts型菌株表达的酶活性在诱导后108h达到最大值,为119U/m L,比活性为1867U/mg,菌体干重为113.5g/L。以上结果表明,Mut+型毕赤酵母更有利于产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的表达。      

通用型毕赤酵母高密度培养策略的网络共享技术

甲醇营养型毕赤酵母是近年来广泛应用的一种外源蛋白表达系统。本课题组在前期研究中构建了一系列能够满足绝大多数毕赤酵母高密度发酵过程工艺控制需求的通用型控制策略:用于细胞培养期的改良型DO-Stat甘油流加策略;用于甲醇诱导期的“甲醇浓度受限-溶解氧浓度充足”诱导控制策略;用于甲醇诱导期的“甲醇浓度充足-溶氧浓度受限”诱导控制策略。然而,这些控制策略的推广需要极高的时间和人力成本。为此,本文开发了基于Django框架搭建的服务器程序,以实现通用型毕赤酵母高密度培养策略的网络共享,并依靠前期开发完成的客户端程序实现控制软件包与不同发酵设备之间的对接。在甲醇利用快型(methanol utilization plusphenotype,Mut+)毕赤酵母表达人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子突变体融合蛋白(HSA-GCSF m)和甲醇利用慢型(methanol utilization slow phenotype,Mut S)毕赤酵母表达人源溶菌酶(hLYZ)实验中分别验证了以上通用型控制策略的网络共享功能。结果表明,Mut+型毕赤酵母诱导60 h后HSA-GCSF m的质量浓度达到532 mg/L;Mut S型毕赤酵母诱导69 h后总酶活达到84032.0 U/mg,对应的比酶活力为52884.0 U/mg;HSA-GCSF m产量和hLYZ活力均达到较优水平。     

朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶在毕赤酵母GS115中的异源表达

目的构建毕赤酵母基因工程菌,以实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。方法人工合成朱黄青霉HI-4的α-1,6-葡聚糖酶基因ZHdex,克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,电转入毕赤酵母GS115。甲醇诱导目的蛋白表达。结果成功在毕赤酵母GS115中对ZHdex基因进行表达,SDS-PAGE表明重组毕赤酵母在66×103附近有目的蛋白表达,与理论值一致。在摇瓶水平,甲醇诱导培养120 h后,α-1,6-葡聚糖酶的最高酶活达28.79 U/mL,蛋白质浓度为0.56 mg/mL。结论获得一株重组毕赤酵母GS115-ZHdex,其产物具备α-1,6-葡聚糖酶活性,成功地实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。     

Muts型基因重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中甲醇流加的控制

在采用Muts 表型基因重组巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)发酵生产血管生长抑制因子(angiostatin)的过程中 ,诱导表达阶段甲醇的质量浓度对血管生长抑制因子的表达至关重要 .因重组Muts 型巴斯德毕赤酵母利用甲醇极慢 ,按文献方法流加甲醇时 ,甲醇逐渐积累达 30 g/L ,血管生长抑制素表达水平仅为 4mg/L .采用甲醇检测与控制系统对甲醇流加进行反馈控制后 ,甲醇质量浓度可稳定控制在设定范围 .采用此系统控制诱导阶段的甲醇流加 ,同时手动流加适量甘油以促进细胞生长 ,血管生长抑制因子表达水平量最高可达 89mg/L .     

牛透明质酸酶PH-20核心区在毕赤酵母中的高效表达

目的利用毕赤酵母表达牛源透明质酸酶核心区,以实现透明质酸酶的重组制备。方法将去除信号肽和锚定区域的牛源透明质酸酶PH-20成熟肽编码序列按照毕赤酵母密码子偏爱性进行优化,然后连入pPICZaA表达载体并转入毕赤酵母SMD1168H菌株。0.5%（v/v）甲醇诱导表达72 h后采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid,DNS）法测定培养液上清中透明质酸酶活性。结果包含PH-20核心序列（1332 bp）的重组酵母经甲醇诱导表达72 h,培养液上清中透明质酸酶活性达135.2 U/mL。结论实现了牛源透明质酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达。     

重组毕赤酵母产a-葡聚糖酶甲醇流加控制的研究

本文在摇瓶发酵的基础上,利用5L发酵罐进行重组毕赤酵母甲醇诱导产Ⅸ．葡聚糖酶发酵条件的优化。结果表明,菌体湿重250g／L时开始诱导,诱导表达阶段溶氧控制在10％～20％,甲醇诱导90h时仪．葡聚糖酶酶活达330U／mL。     

朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

α-1,6-葡聚糖酶是专一作用于α-1,6糖苷键产生小分子葡聚糖的一类水解酶,广泛的运用于制糖工业和啤酒工业中。采用PCR法扩增朱黄青霉（Penicillium minioluteum）C12114的α-1,6-葡聚糖酶基因,将其插入毕赤酵母表达载体pPIC9K。经SacI酶线性化电击转入毕赤酵母基因组,构建重组酵母GS115/pPIC9K-dex。对构建成功的转化子进行1.5%的甲醇诱导表达,在30℃条件下培养7d时酶活达到最大值,为88.35U/mL。      

一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母密码子偏好性对来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因进行优化并构建在细胞内表达普鲁兰酶的重组毕赤酵母。优化后普鲁兰酶编码基因Bd P4在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达水平平均比优化前的普鲁兰酶基因Bd P提高4倍以上。筛选到1株表达水平较高的重组菌Pichia pastoris GS115/p PIC9K-Bd P4 WB54。在5 L发酵罐获得了初步优化的发酵条件:发酵液p H 4.5,在菌体量达到87 g/L时开始甲醇流加,采用溶氧(DO)恒定策略控制甲醇流加,DO控制在25%的水平,甲醇流加速率为9.9 m L/(L·h),搅拌转速控制在最大值800 r/min,通风量2 V/(v·m)。在优化条件下重组菌发酵酶活在2 000 U/m L以上。重组酶最适p H为4.0,最适作用温度50℃,在50和55℃下酶活半衰期分别为32和18 h。     

表达牛肉风味肽的重组毕赤酵母部分生物学特性的研究

对分泌表达16拷贝牛肉风味肽毕赤酵母工程菌株)的生物表型、生长特性、表达特性及遗传稳定性等进行了研究.结果表明:该重组菌株的表型为Mut+:在5L发酵罐中,采用BSM培养基,设定适合的菌体培养温度和pH值,通过调节搅拌速度、通气量和罐压等措施使溶氧(DO)维持在20%～35%,当诱导90h后(发酵110h),目的产物BMP的表达量达到最高为54 mg/L,是其摇瓶水平的5.4倍;遗传稳定性分析实验及PCR检测结果证明,重组菌株具有良好的遗传稳定性和重组蛋白表达的稳定性.     

烟曲霉壳聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

为了筛选高效表达壳聚糖酶的毕赤酵母菌株。重组质粒pPIC9K-CSN经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut+转化子,PCR鉴定后,用G418梯度浓度筛选多克隆子,用甲醇诱导摇瓶分泌表达。经PCR分析,质粒转到宿主菌GS115,在G418为4mg/mL时,筛选到了多克隆子,经SDS-PAGE分析表明分泌表达蛋白的相对分子量约为25kDa,酶活为14.59 U/mL。     

高果糖浆废液杂糖组分分析及其作为毕赤酵母发酵碳源的资源化利用

废杂糖的资源化利用是高果糖浆生产行业迫切需要解决的问题。该研究首先通过高效液相、质谱和红外光谱分析,确定了杂糖成分为葡萄糖、果糖和聚合度为2~16的线性葡聚糖,包括葡萄糖480 g/L,果糖92 g/L,麦芽糖103.6 g/L,麦芽三糖36.8 g/L,总糖含量802.3 g/L。进一步使用2种常用的毕赤酵母宿主(P AOX1型毕赤酵母、P GAP型毕赤酵母)利用杂糖发酵生产内切β-1,3葡聚糖酶并与标准碳源(甘油和葡萄糖)作对比。结果表明,对于P AOX1型毕赤酵母,杂糖做碳源时细胞密度和酶活性与甘油相比均有所下降,最大生物量分别为59.1和82.0 g/L,最高酶活性分别为157.29和199.2 U/mL。对于P GAP型毕赤酵母,杂糖与葡萄糖的发酵效果相当,说明杂糖可以作为P GAP型毕赤酵母生产内切β-1,3葡聚糖酶的优质替代性碳源。     

RT-qPCR分析拷贝数及mRNA转录水平对表达左聚糖蔗糖酶的影响

采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）技术对重组毕赤酵母基因组中左聚糖蔗糖酶基因（SacB）的拷贝数及信使核糖核酸（mRNA）转录水平进行检测分析,并用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定菌株不同诱导时间下左聚糖蔗糖酶水解活力。结果表明,在BMMY液体培养基中经甲醇诱导24 h时,样品转录水平皆达到最大值,此时多拷贝菌株转录水平（2.13）为单拷贝菌株（0.42）的5.1倍;左聚糖蔗糖酶活力在甲醇诱导24 h后均随诱导时间不断上升,多拷贝菌株酶活（13.96 U/mL）较单拷贝菌株（5.48 U/mL）提高1.5倍。重组毕赤酵母整合的左聚糖蔗糖酶基因在1～3个拷贝范围内,随着拷贝数增加,多拷贝菌株较单拷贝菌株的mRNA转录水平及相应的蛋白表达量均显著增加（P＜0.05）,说明毕赤酵母是表达基因SacB的良好宿主。     

内切葡聚糖酶与木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达

为实现内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达,进而降低酶制剂的生产成本,构建含木聚糖酶基因的重组表达载体pPICZαA-Aoxyn11A,经SacI线性化后,电转化至含内切葡聚糖酶基因Aucel12A的重组毕赤酵母GSC7中,获得双重重组毕赤酵母GSCX8。经甲醇诱导表达后,GSCX8发酵上清液中内切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性分别为47.77IU/mL和192.71IU/mL,为单独表达菌株GSC7和GSX5的85%和80%。酶学性质分析显示,内切葡聚糖酶的最适pH为4.0,在pH3.0~8.5稳定;最适温度为50℃,在60℃以下稳定。木聚糖酶的最适pH为5.5,在pH3.0~10.0稳定;最适温度为55℃,在50℃以下稳定。GSCX8遗传稳定性测试结果表明,内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中实现了稳定的共表达。     

耐热赖氨酸氨肽酶毕赤酵母表达及培养条件优化

为实现耐热耐氨酸氨肽酶的异源表达,通过PCR扩增技术从Pseudomonas aeruginosa NJ-814基因组中克隆获得耐热的赖氨肽酶基因(PLAP),构建重组载体p PIC9K-PLAP,并最终实现在毕赤酵母GS115中的分泌表达。对重组毕赤酵母进行初步筛选,单因素实验优化获得重组毕赤酵母最佳诱导条件如下:诱导培养基初始pH为5.0、甲醇质量浓度1.5 g/dL、诱导温度28℃、装液量25 mL/250 mL、Co~(2+)浓度50μmol/mL、山梨醇添加量9 g/L。在最优条件下,氨肽酶酶活提高了5.2倍,比酶活2.74 U/mg。实验结果表明:PLAP基因已成功转入毕赤酵母GS115并获得表达。     

中华蜜蜂乙酰胆碱酯酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达鉴定

有机磷污染是食品安全的重大隐患,乙酰胆碱酯酶(Acetyl cholinesterase,ACh E)可用于有机磷农药残留的检测。中华蜜蜂是我国独有的蜜蜂当家品种,蜜蜂对农药的敏感性很高,中华蜜蜂来源的乙酰胆碱酯酶基因尚未被克隆并应用于食品安全监测。以中华蜜蜂头部组织总RNA为模板,经RACE方法获得了ACh E基因c DNA全序列,全长约1.8 kb。构建重组表达载体p PIC3.5K-ACh E,将目的基因表达盒整合入毕赤酵母GS115的基因组中获得重组菌株,0.5%甲醇诱导重组菌株表达ACh E蛋白,经SDS-PAGE、酶活性分析表明,中华蜜蜂ACh E基因首次克隆成功并首次在毕赤酵母中获得成功表达,筛选出一株酶活性较高的菌株,纯化的重组乙酰胆碱酯酶其活性为10 568 U/mg,可以用于有机磷农药残留的检测。     

疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达和性质鉴定

通过密码子优化改造编码sn-1,3位置专一性疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)基因,同时通过重叠PCR技术合成该基因,并将其克隆到巴斯德毕赤酵母的表达载体p PIC9K中。结果表明,TLL脂肪酶被高效胞外表达,在摇瓶中发酵168 h得到的发酵液的上清脂肪酶表达量达到0.1 mg/m L,对应的p NPP水解酶活达到312.72U/m L。与对应的原始编码基因重组菌酶活(179.42 U/m L)相比,密码子优化后酶活提高74.29%,表明密码子优化策略成功提高了TLL在巴斯德毕赤酵母中的重组表达。比较毕赤酵母来源的重组TLL与商业化的米曲霉酶学性质发现它们具有相似的最适p H和温度耐受范围。另外,它们在有机溶剂耐受性、表面活性剂和金属离子效应以及位置选择性方面均较为相似,表明毕赤酵母来源的重组TLL同样具有商业化应用的潜力。     

嗜热裂孢菌木聚糖酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质

将优化后的来自嗜热裂孢菌的木聚糖酶基因在毕赤酵母中进行异源表达并分析了其表达产物的酶学性质。对来源于嗜热裂孢菌的木聚糖酶基因催化域进行密码子优化,人工合成优化后的木聚糖酶成熟肽基因xyl11~M,构建重组表达质粒pPIC9K-xyl11~M,将其经SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经G418筛选得到重组工程菌GS115/xyl11~M,甲醇诱导表达重组蛋白。表达的重组蛋白reXyl11M经SDS-PAGE分析,其相对分子质量约34 000,酶活性可达到105.3 U/m L,最适反应温度为70℃,并在30~75℃温度内较稳定;最适反应pH为6.0,在pH6.5~7.5范围内稳定;Co~(2+)、Ba~(2+)、Cu~(2+)、Li~+对酶活性有强烈的激活作用,Fe~(3+)有明显的抑制作用,其它金属离子及EDTA对re Xyl11M酶活性影响不大。结果表明xyl11M成功在毕赤酵母GS115中实现表达,且reXyl11~M的酶学特性优良。     

重组毕赤酵母发酵生产α-葡聚糖酶的放大研究

研究了毕赤酵母高密度发酵组成型表达α-葡聚糖酶,从6.8 L发酵罐逐级放大至5000 L发酵罐的放大工艺。采用恒定p H和控制甘油残留浓度和溶解氧相结合的调控策略,进行了多批次的发酵试验。结果表明:三磷酸甘油醛脱氢酶启动子驱动的α-葡聚糖酶的生成具有生长偶联特征,集中在对数生长期和稳定期。6.8 L发酵罐中上清酶活达1253 U/m L,中试放大至50 L发酵罐中产酶最高达1300 U/m L,500 L发酵罐中酶活为740 U/m L。5000 L规模发酵罐中产酶达到589 U/m L。建立了以甘油作为碳源,发酵调控简单的工艺,避免了使用甲醇带来的安全问题,适合放大生产。     

玉米谷氨酰胺酶基因在毕赤酵母中表达条件的优化

为确定玉米谷氨酰胺转氨酶基因在毕赤酵母中的最佳诱导表达条件,将构建好的重组表达载体pPIC9K-TGZ经Sac I线性化处理,电转入巴斯德毕赤酵母GS115,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,聚合酶链式反应扩增验证,甲醇诱导表达。通过正交试验确定工程菌最佳表达条件:表达培养基BMMY,诱导表达时间96 h,初始表达pH值6.0,菌体起始诱导OD600nm值4.0,诱导温度24 ℃,甲醇添加量0.6%(体积分数)、甲醇流加时间间隔12 h/次,诱导48 h后每24 h添加1 g/L甘油。采用优化的条件得到培养基上清的最高酶活达7.51 U/mL。     

共表达伴侣蛋白对毕赤酵母产β-甘露聚糖酶发酵过程的影响

通过分别共表达伴侣蛋白PDI和Bip获得β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达。根据Gen Bank公布的毕赤酵母PDI和Bip序列设计引物,以酵母基因组为模板PCR扩增目的基因片段,插入表达载体p PICZαA,分别整合到β-甘露聚糖酶工程菌中,筛选共表达二硫键异构酶的重组酵母(PM115)和共表达免疫球重链结合蛋白的重组酵母(BM115),在30 L发酵罐水平上分析两种共表达伴侣蛋白菌株与初始菌株(GM115)对β-甘露聚糖酶表达的差异。相同工艺下,PM115与原始菌株相比未有提高,而BM115发酵产酶能力高于原始菌株,最高酶活达到40 900 U/m L,最高总蛋白表达量13.22 g/L,最高比酶活达到3 150 U/mg,分别比初始菌株提高38%,22%和18%。毕赤酵母基因工程菌GM115通过共表达伴侣蛋白Bip,提高了β-甘露聚糖酶的产量和比活力,达到工业化生产水平。