发酵法制备S-腺苷-L-甲硫氨酸的研究进展

S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）是甲硫氨酸和ATP相结合的代谢产物,广泛存在于动植物和微生物体内,参与40多种生化反应,临床上被广泛用于治疗肝病、抑郁症、关节炎等。SAM制备方法包括化学合成法、微生物发酵法、体外酶促转化法以及全细胞催化法。详细阐述了SAM的微生物发酵制备方法的国内外研究现状。     

发酵法制备S-腺苷-L-甲硫氨酸的研究进展

S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）是甲硫氨酸和ATP相结合的代谢产物,广泛存在于动植物和微生物体内,参与40多种生化反应,临床上被广泛用于治疗肝病、抑郁症、关节炎等。SAM制备方法包括化学合成法、微生物发酵法、体外酶促转化法以及全细胞催化法。详细阐述了SAM的微生物发酵制备方法的国内外研究现状。      

高产S-腺苷甲硫氨酸酵母菌株的筛选

从土壤和酒曲中对产S-腺苷甲硫氨酸的酵母菌株进行了筛选,通过HPLC外标法测定得到8株产量较高的酵母菌株。对高氯酸细胞破壁和酵母细胞水解作用条件进行优化,确定了高氯酸提取S-腺苷甲硫氨酸的理想条件为2.5mol/L高氯酸10mL,时间为5h,菌体量为0.6g。     

富含S-腺苷甲硫氨酸面包酵母的发酵工艺优化

对摇瓶发酵生产富含S-腺苷甲硫氨酸的面包酵母的培养条件和培养基成分进行了优化,单因子实验结果表明,发酵最适pH值为5.0,最适装液量为70/250 mL,最佳接种量为2%。正交优化实验结果表明,最佳培养基成分为12°Brix糖蜜,另加酵母粉6.667g/L,(NH4)2SO4 2.829g/L,MgSO4 0.2g/L,ZnSO4 0.1g/L,KH2PO4 1g/L,在该条件下,S-腺苷甲硫氨酸产量为14.26 mg/L,含量为1.64 mg/g,分别提高了76.5%和84.3%。     

不同来源S-腺苷甲硫氨酸合酶在大肠杆菌中的表达及催化应用

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)是一种重要的代谢中间体,对机体代谢活动的正常运行起重要作用,它是由底物L-甲硫氨酸和ATP在SAM合酶催化下生成的,目前主要应用于医药行业。该研究首先以蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus和谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum基因组为模板扩增出SAM合酶编码基因BcmetK和CgmetK,以pETDueT1质粒为载体,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为底盘细胞,构建了SAM合成菌株E.coli BL21/pETDuet1-BcmetK和E.coli BL21/pETDuet1-CgmetK。其次,针对SAM合成菌株全细胞催化合成体系条件进行了优化,重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-BcmetK在最优条件[L-甲硫氨酸浓度50 mmol/L、ATP浓度50 mmol/L、1.2%(体积分数)的OD₆₀₀值约9.0的细胞悬浮液、600 mmol/L pTSoNa、50 mmol/L MgSO₄、100 mmol/L...     

解淀粉芽孢杆菌mtnN基因对其生物合成S-腺苷甲硫氨酸的影响

为探索解淀粉芽孢杆菌中m t n N基因编码的S-腺苷高半胱氨酸核苷酶对S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)合成的影响,通过基因敲除技术和反义RNA抑制技术构建了针对mtnN基因的系列工程菌株。与出发菌株HZ-12相比,缺失mtnN基因的菌株SAM产量和生物量分别下降了51%和26%,说明完全阻断该基因不利于菌体的生长和产物的合成。进一步通过反义RNA微调抑制mtnN基因的表达,与对照菌株HZ-12/pHY300相比,所构建的反义RNA工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1、HZ-12/pHY-mtnNasRNA-2和HZ-12/pHYmtnNasRNA-3生物量没有显著性变化,且其SAM产量分别达到14.58、12.27 mg/L和12.49 mg/L,相比对照分别提高了44%、22%和24%。本研究不仅阐释了mtnN基因对SAM合成的影响规律,而且为SAM高产工程菌株的构建提供了新的思路。     

多胺对毕赤酵母合成S-腺苷甲硫氨酸的影响

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是一种需求量巨大的活性氨基酸。SAM生产主要是利用过表达甲硫氨酸腺苷转移酶(methionine adenosyltransferase,MAT)的毕赤酵母(Pichia pastoris)进行胞内合成,但较高密度培养条件下甲醇诱导会造成一定程度的细胞死亡。本研究首先揭示甲醇对P.pastoris造成过氧化损伤,然后分析了添加多胺(腐胺和亚精胺)对SAM合成影响及机制。结果揭示多胺可提高H2O2酶活力,从而缓解细胞氧化损伤,此外还改善了MAT酶活力和细胞生长,最终SAM的积累水平提高19.2%。     

几种细胞破碎方法对提取S-腺苷甲硫氨酸的研究

考察几种提取S-腺苷甲硫氨酸的细胞破碎方法,包括超声波法、化学渗透法及冻融法.结果表明,用化学渗透法提取SAM较其他方法破碎率较高,其中又以20%三氯乙酸破碎效果最佳.     

抑制剂对Pichia生产S-腺苷甲硫氨酸的作用及机制

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是市场前景广阔的高价值氨基酸.为通过削弱胞内SAM消耗而进一步提高其积累量,作者在诱导型和组成型P.pastoris发酵后期添加3种抑制剂.首先考察其作用并比较其差异,然后分析其机制.结果显示,添加S-腺苷高半胱氨酸水解酶抑制剂Aristeromycin有助于SAM积累,但比较而言,其在诱导型酵母中最适添加质量浓度更低,很可能因为甲醇代谢导致的氧化胁迫使细胞对甲基化作用依赖性增强.添加多胺合成抑制剂DFMA有利于SAM积累,但添加过多对细胞生长和抗氧化不利.组成型酵母中添加7.5 g/L乙酸可通过抑制多胺生成而增强SAM积累.3种抑制剂均可有效提高P.pastoris中SAM产量.     

壳聚糖膜固定化葡萄糖氧化酶的特性研究

研究了以壳聚糖膜为载体、戊二醛为交联剂的固定化葡萄糖氧化酶的特性。结果表明：固定化酶、溶液酶的最适pH均为5．5；固定化酶、溶液酶的最适温度分别为40℃，35℃；固定化酶的Km值为12．16mmol／L，溶液酶的Km值为20．86mmol/L；固定化酶比溶液酶更耐热，且贮藏稳定性及操作稳定性也有所提高；该固定化酶重复使用率较高。     

壳聚糖固定化超氧化物歧化酶的研究

目的:研究壳聚糖固定化超氧化物歧化酶的酶学性质。方法:分别以不同方法对超氧化物歧化酶进行固定并比较其活力,对固定化方法进行相应的优化,对固定化超氧化物歧化酶进行酶学性质测定。结果:以壳聚糖为载体,戊二醛交联法制备固定化超氧化物歧化酶,优化条件下制备的固定化酶,所得固定化酶活力为330U/g,酶活回收率为58.33%,热稳定性和酸稳定性较游离酶有很大的提高,且具有良好的贮存稳定性,固定化酶可实现反复使用,提高了利用率。结论:壳聚糖-戊二醛交联法可用于制备性能较优的固定化超氧化物歧化酶。     

磁性壳聚糖复合微球固定化葡萄糖异构酶制备及性能研究

通过化学共沉淀法合成纳米级Fe3O4粒子,并将其作为磁核,采用乳化交联法制备磁性壳聚糖复合微球,用SEM、FT-IR及激光粒度仪对微球结构进行表征。以磁性复合微球为载体,对葡萄糖异构酶进行固定化,并对固定化酶的参数、性质以及动力学参数进行研究。试验结果表明:磁性复合微球呈圆球形,具有较好的磁性。在加酶量12 mg/mL、戊二醛体积分数2%、交联时间2 h、振荡时间6 h条件下可以得到较佳的固定化效果,其酶活回收率达84.7%。对固定化酶性质的测定结果显示,最适Mg2+浓度0.01 mol/L,最适Co2+浓度0.003 mol/L,最适pH 7.2,最适温度75℃。通过计算其半衰期为40 d。对动力学参数的测定结果是:固定化酶的米氏常数为9.720,游离酶的米氏常数为8.190。     

磁性壳聚糖微球固定化果胶酶的研究

以壳聚糖复合Fe3O4为载体,采用吸附．交联法固定化果胶酶。考察壳聚糖的脱乙酰度、分子量对微球载体形态的影响;对固定化过程中酶浓度、pH值、温度、时间等因素进行考察;采用正交试验设计对载体制备与酶固定化中的主要条件进行优化。结果表明,随着壳聚糖脱乙酰度、分子量的增加,载体表现出良好性能;脱乙酰度为95％、分子量为20万的壳聚糖浓度为3％、Fe3O4的加量与壳聚糖质量比为1：3、戊二醛浓度为3％、酶加量为0．3ml时,固定化果胶酶活力最高,其酶活保存率为79％。     

脱乙酰壳聚糖固定碱性蛋白酶的研究

以脱乙酰壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂制备固定化碱性蛋白酶。研究了戊二醛的浓度、给酶量、固定化温度、时间、pH对固定碱性蛋白酶的影响。结果表明：碱性蛋白酶最佳固定化条件是戊二醛浓度为0．2％：给酶量11000U／g；pH为10；在温度为50℃交联时间12h。     

磁性壳聚糖微球固定化胃蛋白酶的研究

利用反相悬浮交联法制备壳聚糖微球,然后采用化学共转化法制备了磁性壳聚糖微球(magnetic chitosan microspheres,M-CS),并对胃蛋白酶进行固定化研究。结果表明,制备的M-CS呈规则圆球形,有很好的磁响应性,并且在弱酸弱碱环境下能稳定保存。磁性壳聚糖微球对胃蛋白酶的吸附性实验表明,磁性壳聚糖微球能吸附胃蛋白酶,可是吸附胃蛋白酶的量受到载体与酶比例、溶液的离子浓度、溶液的pH值影响很大。胃蛋白酶动力学性质研究表明,相对于游离的胃蛋白酶,固定化后的酶的最适温度有所升高,最适温度在60℃、酸碱稳定性略有改善,最适pH4.0,故固定化后的酶的热稳定性和酸碱稳定性都得到明显改善。     

壳聚糖微球固定碱性蛋白酶的研究

利用乳化交联法制得壳聚糖微球并用于碱性蛋白酶的固定,借助正交试验设计优化酶固定化条件,结果表明：常温条件下,戊二醛浓度为1％,以给酶量240U／g载体加酶,在pH10缓冲液中,交联20h时,固定化碱性蛋白酶的活力和活力回收率可达到119U／g和49．6％;固定化碱性蛋白酶耐热性较游离碱性蛋白酶较强,4℃的半衰期可达14d。     

壳聚糖固定化木瓜蛋白酶提取牛蒡多糖的研究

以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂固定化木瓜蛋白酶,从牛蒡中提取多糖,考察固定化工艺的选择、固定化酶提取牛蒡多糖的优化条件及固定化酶的稳定性。结果表明:壳聚糖固定化木瓜蛋白酶的最佳条件为:壳聚糖浓度2.5%,加酶量0.3g/g载体,时间6h,温度15℃,pH7.5,酶活力回收率38.98%。提取牛蒡多糖的最佳条件为:固液比1:20,pH6.5,温度60℃,时间8h,加酶量1.8g/g载体,多糖提取率11.04%。固定化酶重复使用五次,酶活力仍保持50%以上。     

磁性壳聚糖微球固定化糖化酶的研究

以磁性壳聚糖微球为载体,采用吸附一交联法固定化糖化酶。对给酶量、戊二醛添加量、交联温度、交联时间等因素进行了考察;并对固定化酶的酶学性质进行了研究。结果表明,固定化的最佳条件为：浓度为0．5mg／mL酶液8mL、1％戊二醛溶液4mL、交联温度45℃、交联时间4h;固定化酶的热稳定性和pH稳定性都优于游离酶;固定化酶连续使用5次,酶活仍保持了58％。