尾加压素Ⅱ对体外高糖培养大鼠肾小球系膜细胞周期的影响

目的观察尾加压素Ⅱ(UⅡ)对体外高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞周期的影响。方法体外高糖培养大鼠肾小球系膜细胞,加入不同浓度的UⅡ(10-7、10-8、10-9和10-10mol/L),37℃孵育24h,用碘化丙啶染色流式细胞术分析肾小球系膜细胞周期分布。结果UⅡ对体外高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞有明显的促增殖作用,表现为细胞周期S期比例增加,以浓度为10-8mol/L时最明显。Ca2+阻断剂尼卡地平、Ca2+螯合剂EDTA及抗UⅡ抗体能明显抑制其促增殖作用。结论UⅡ能提高体外高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞S期DNA合成速率,提示UⅡ对其具有明显的促增殖作用。     

糖基化终末产物对大鼠肾小管上皮细胞组织型转谷氨酰胺酶mRNA表达的影响

目的探讨晚期糖基化终末产物(Advanced glycosylation end products,AGEs)对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E组织型转谷氨酰胺酶(Tissue transglutanunase,tTG)mRNA表达及其对细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)降解的影响。方法体外培养NRK-52E细胞,分别用体外合成的不同浓度的糖化牛血清白蛋白(AGE-BSA)及未经糖化的牛血清白蛋白(BSA)处理48h,ELISA法检测细胞培养上清中纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)和Ⅳ型胶原蛋白(TypeⅣcollagen,ColⅣ)含量,RT-PCR检测细胞tTG mRNA的表达。结果与BSA组比较,50～200mg/LAGE-BSA组细胞上清中FN含量明显增加(P<0.01),25～100mg/L AGE-BSA组细胞上清中ColⅣ含量明显增加(P<0.05);AGE-BSA(50～400mg/L)可不同程度地刺激细胞tTG mRNA表达的增加(P<0.05);tTG mRNA表达增加与FN、ColⅣ分泌增多呈正相关(r值分别为0.911和0.872)。结论 AGEs能诱导大鼠近端肾小管上皮细胞tTG mRNA的表达,引起ECM主要成分FN和ColⅣ含量增加,提示tTG可能在AGEs引起的ECM积聚过程中,起到抑制ECM蛋白降解的作用,进而参与糖尿病肾病的病理过程。     

尾加压素Ⅱ对大鼠近端肾小管上皮NRK-52E细胞增殖和细胞周期的影响

目的探讨尾加压素Ⅱ(UⅡ)对大鼠近端肾小管上皮NRK-52E细胞增殖和细胞周期的影响及其机制。方法在NRK-52E细胞培养液中加入10-10、10-9、10-8和10-7mol/L UⅡ,同时设UⅡ活性阻断组:UⅡ+尼卡地平和UⅡ+EDTA,以单纯DMEM为对照组。培养48 h后,采用5-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入法检测各组细胞的增殖活性,流式细胞术分析细胞周期。结果UⅡ(10-10~10-8mol/L)以浓度依赖方式促进NRK-52E细胞BrdU掺入(A值分别为0.491±0.038、0.291±0.024和0.281±0.037),其中以10-8mol/L UⅡ的作用最明显,10-7mol/L UⅡ对NRK-52E细胞增殖的影响与对照组比较差异无显著意义。UⅡ影响NRK-52E细胞周期,在10-10~10-8mol/L浓度范围内增加S期细胞百分比(分别为26.96%±3.35%、44.26%±3.28%、48.12%±2.22%)。尼卡地平和EDTA均可以降低UⅡ诱导NRK-52E细胞的BrdU掺入增加,降低S期细胞百分比。结论UⅡ具有较强促进NRK-52E细胞增殖的作用,但大剂量则无此作用,其诱导NRK-52E细胞增殖作用部分是通过Ca2+内流来介导的。     

靶向G偶联蛋白受体87基因shRNA重组表达质粒的构建及鉴定

目的构建靶向G偶联蛋白受体(G protein-coupled receptor,GPR)87基因的shRNA重组表达质粒,并进行鉴定。方法根据NCBI基因数据库中的GPR87基因mRNA序列设计并合成3对靶向GPR87基因的shRNA,同时设阴性对照GPR87-HK序列,分别与线性化质粒pGenesil-1.1连接,构建靶向GPR87基因的shRNA重组表达质粒GPR87-1、GPR87-2、GPR87-3及GPR87-HK,在Lipofectamine 2000介导下,分别转染BIU87膀胱癌细胞,通过RTPCR和Western blot法检测各组细胞中GPR87基因mRNA转录和蛋白表达水平,并计算表达抑制率。结果 3种重组质粒经单酶切及测序鉴定,证明构建正确;转染BIU87膀胱癌细胞48 h后,镜下观察均可见绿色荧光;GPR87-1组、GPR87-2组和GPR87-3组细胞中GPR87基因和蛋白表达水平均显著低于GPR87-HK组(P0.01),mRNA表达抑制率分别为76%、52%和50%,蛋白表达抑制率分别为90%、45%和41%。结论成功构建了靶向GPR87基因的shRNA重组表达质粒,为后续研究GPR87基因对膀胱癌细胞的增殖、凋亡及耐药的影响奠定了基础。     

双参粗提组分对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞的影响

研究药用植物双参对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞异常增殖的影响,本实验对双参进行水提,水提液经脱蛋白、脱色素以及95%乙醇醇沉,得到双参粗提组分。检测该组分对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞异常增殖的抑制作用,以及其对高糖模型细胞中氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明,该双参粗提组分可明显抑制高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞的异常增殖,同时可显著提高模型细胞中SOD的活力,降低MDA的含量,提示其对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞具有保护作用。     

小鼠微RNA miR-21真核表达质粒的构建及其在小鼠肾小球系膜细胞中的表达

目的构建小鼠微RNA miR-21真核表达质粒,并在小鼠肾小球系膜细胞中表达。方法人工合成小鼠miR-21基因序列,构建miR-21真核表达质粒pGenesil-miR-21。使用脂质体Lipofectamine2000转染小鼠肾小球系膜细胞后,G418筛选,获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过实时荧光定量RT-PCR技术检测miR-21的表达。结果经酶切鉴定和测序证实,合成的miR-21基因序列完全正确,并已成功克隆到真核表达质粒pGenesil-1上。重组真核表达质粒转染小鼠肾小球系膜细胞后,筛选出的阳性克隆可稳定高表达miR-21。结论已成功构建miR-21真核表达质粒,并在小鼠肾小球系膜细胞中高效表达,为进一步探讨miR-21的生物学功能奠定了基础。     

桑叶中1-脱氧野尻霉素的提取和对高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡和炎性因子的影响

目的：对桑叶中1-脱氧野尻霉素的提取条件进行优化后研究其对高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡和炎性因子的影响。方法：建立1-脱氧野尻霉素的定量检测方法，探讨桑叶中1-脱氧野尻霉素的最佳提取条件。培养小鼠肾小球系膜(SV40 MES 13)细胞，并分为四组：正常对照组(PBS)、高糖组(30mmoL/L葡萄糖)和1-脱氧野尻霉素组(2、50μM)，给药结束后采用CCK-8法测定SV40MES13细胞的存活率，ELISA测定炎性因子单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)和白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)的水平。最后用Western blotting法检测细胞增殖蛋白Cyclin D1和PCNA的表达水平。结果：桑叶中1-脱氧野尻霉素的提取条件最终优化为料液比1:15 g/mL、p H值3.0和提取时间30 min。1-脱氧野尻霉素明显提高SV40 MES 13细胞的存活率，并下调炎性因子IL-6的表达水平，且高剂量的1-脱氧野尻...     

人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白重组CHO细胞生产工艺及质控方法的建立

目的 利用国产无血清培养基T22,建立人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)重组CHO细胞大规模生产工艺及质控方法。方法用500 L生物反应器培养重组CHO细胞,通过深层过滤、亲和层析、离子交换层析、疏水层析等方法纯化表达上清中的目的 蛋白,超滤浓缩制成原液,并按照《中国药典》三部(2010版)及现有的质控方法和标准建立相应的质控方法。结果重组CHO细胞在500 L生物反应器中培养15 d左右,细胞密度最高可达8.6×106个/ml,收获时细胞活力为70%左右,rhTNFR:Fc蛋白表达量可达3.3 g/L;纯化的目的 蛋白纯度可达98%以上,总收率超过30%;各项质量指标均符合新药申报标准。结论建立的rhTNFR:Fc重组CHO细胞生产工艺及质控方法稳定可靠,使用国产培养基大大降低了生产成本。     

二氢睾酮对大鼠视网膜神经节细胞-5神经突起再生及RhoA和神经突蛋白表达的影响

目的探讨二氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)对损伤后大鼠视网膜神经节细胞-5(retinal ganglion cell-5,RGC-5)神经突起再生及RhoA和神经突蛋白(neuritin)表达的影响。方法 RGC-5经十字孢碱诱导分化后,将细胞分为正常对照组、模型组[用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)制备大鼠RGC-5神经突起氧糖剥夺/复氧损伤模型]和DHT干预组(终浓度分别为1、10、100 nmol/L),采用MTT比色法测定各组细胞的存活率;显微镜下观察神经突起长度和数量;RT-PCR和Western blot法分别检测RGC-5中RhoA和Neuritin基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平。结果与模型组比较,10和100 nmol/L DHT干预组及正常对照组的细胞存活率和神经突起数量均明显上升(P均0.05);1、10和100 nmol/L DHT干预组及正常对照组的神经突起长度、Neuritin基因mRNA转录水平和蛋白表达量均明显增加(P均0.05),RhoA基因mRNA转录水平及蛋白表达量均明显减少(P均0.05)。结论 RhoA和Neuritin可能是影响RGC-5神经突起再生的重要因子,DHT可能通过调节RhoA和Neuritin的表达,从而发挥神经保护作用。     

在小鼠胚胎干细胞系嵌入碳酸盐碳灰石DNA载体的上皮细胞钙粘蛋白及纤维蛋白元细胞粘附蛋白对转基因的运输和表达的影响

干细胞有通过基因操作分化为某一特定类型的细胞的潜力，因此，在再生药品中代表了有一个新的和多能的细胞替换来源。然而，常规方法将基因转移到这些祖细胞，有一些弊端，特别是涉及安全性和有效性问题。最近报道了生物功能的碳酸盐碳灰石的DNA载体嵌入纤维连接蛋白和上皮细胞钙粘蛋白载体嵌合体的发展，导致其与胚胎干细胞表面高亲和力的相互影响，并为随后的表达加快转基因运输。在这里，我们展示利用DNA，细胞粘附蛋白和无机晶体合成高功能复合粒子的分子基础，最后为对细胞基础治疗具有应用潜力的小鼠干细胞系建立一个高度转染机制。