不同非氧化磷酸戊糖途径基因的过表达对酿酒酵母木糖发酵性能的影响

以双拷贝过表达木糖代谢上游途径关键酶(木糖还原酶XR、木糖醇脱氢酶XDH和木酮糖激酶XKS)的酿酒酵母菌株为背景,在过表达非氧化磷酸戊糖(PP)途径中转醛酶基因TAL1的基础上,对途径中其他基因TKL1(转酮酶)、RPE1(核酮糖-5-磷酸差向异构酶)和RKI1(核酮糖-5-磷酸异构酶)进行了不同程度的过表达,以研究PP途径基因过表达对酿酒酵母木糖代谢的影响。在不同培养基条件下对重组菌株木糖代谢进行研究,结果显示,在过表达TAL1的基础上不同组合过表达PP途径其他基因不同程度改善了酿酒酵母木糖发酵性能,重组菌株能在36~48 h耗完质量分数(下同)为5%的木糖。其中,过表达PP途径全部基因比其他过表达基因组合表现出明显的优势,在8%木糖发酵条件下其乙醇产量达到了每1 g木糖0.337 g,较对照菌株提高了7.86%。这说明同步过表达PP途径基因更有利于酿酒酵母木糖发酵。     

纤维素水解液中木糖发酵制丁醇

对实验室菌种进行筛选后,得到一株能利用纤维素水解液木糖发酵生产丁醇的菌株。研究发现,该菌株不仅能利用水解液中的葡萄糖,还可以利用水解液中的木糖。对菌种生长特性探索,批式发酵中碳源、氮源以及CaCO3等条件优化后,得到最佳种子培养时间为20～24 h,并确定了木糖浓度为20 g/L的纤维素水解液用于15 L发酵罐实验,在37 ℃静置培养84 h,丁醇产量10.95 g/L,总溶剂16.78 g/L（丙酮、乙醇、丁醇三者之和）,木糖利用率达到70%以上,总溶剂转化率为39.4%。解决了纤维素水解液中木糖不能被利用而造成的经济损失问题。     

木糖利用融合子D2的制备与乙醇发酵特性

以树干毕赤酵母（Pichia stipitis）1960（Ps1960）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AADY（ScAADY）为亲本菌株,采用双亲灭活原生质体技术制备木糖利用融合子,并对其制备条件进行了优化。优化后的原生质体制备条件为Ps1960采用2%蜗牛酶和1%纤维素酶在28℃酶解45 min,20W紫外灯距离10 cm照射3 min灭活;ScAADY采用1.5%蜗牛酶和1%纤维素酶28℃酶解50 min,55℃水浴50 min灭活;均采用0.6 mol/L山梨醇为渗透压稳定剂。在该条件下,共得到22株融合子。通过测定各融合子在不同培养基条件下的生物量来评价其木糖代谢和乙醇耐受能力,最终获得能利用木糖高效发酵产乙醇、遗传性状稳定的融合子D2,并进行乙醇发酵条件优化。结果表明,在混合糖质量分数8%、木糖和葡萄糖质量比6：1、5%接种量、30℃、160 r/min、培养72 h条件下,融合子D2发酵产乙醇的产量为40.58 g/L。     

响应面优化木糖母液发酵产丁二酸

对产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）GXAS137发酵木糖母液产丁二酸的条件进行优化,探索利用废弃木糖母液合成高附加值丁二酸的可行性。首先通过Plackett-Burman实验设计确定影响丁二酸发酵的显著因子,然后采用最陡爬坡实验逼近各显著因子的最优区域,最后通过Box-Behnken实验设计确定各因子的最优水平。影响木糖母液发酵产丁二酸的显著因子及最优浓度分别为：木糖母液64.75g/L,玉米浆15.71g/L,碱式碳酸镁46.39g/L。在最优发酵培养条件下,丁二酸产量达到38.01g/L,比优化前提高了20.7%,与模型预测值（38.41g/L）基本一致。进一步利用2L发酵罐进行了放大试验,发酵72h丁二酸产量最高可达48.99g/L,较厌氧瓶发酵提高了28.9%,丁二酸得率为0.80g/g总糖。结果表明,采用低价的木糖母液作为底物,可为未来低成本、高效产业化生产丁二酸奠定坚实的基础。     

麦草酸水解及水解液木糖发酵的研究

采用甲酸/盐酸水解体系水解麦草,发现 65℃ 水解 0.5 h 可实现麦草中半纤维素的充分水解。选用热带假丝酵母发酵麦草甲酸水解液制取木糖醇。分别研究了在不同浓度甲酸及甲酸根条件下D-木糖的发酵效果,发现在 2 g/L 的甲酸及 5 g/L 的甲酸根条件下,D-木糖实现发酵并得到最大产率的木糖醇,高浓度的甲酸及甲酸根都会抑制D-木糖的发酵。采用D311型阴离子交换树脂脱除甲酸根,实现了麦草水解液的发酵,木糖醇最高得率为 16.88%(木糖醇/木糖)。     

低聚合度木聚糖对木聚糖酶合成的影响

研究了木聚糖的聚合度和添加黄豆粉对里氏木霉合成木聚糖酶的影响,并以纯化木聚糖酶水解木聚糖。研究结果表明:木聚糖经酶水解后平均聚合度降低54%,戊聚糖含量为75.4%。采用低聚合度木聚糖为底物碳源和添加黄豆粉都可提高产酶效果。以12g/L低聚合度木聚糖添加2g/L黄豆粉,培养3d后木聚糖酶活力可达到113IU/mL,提高49.3%。通过对木聚糖酶进行纯化处理可以有效除去β 木糖苷酶。以体积分数10%的木聚糖酶水解35g/L木聚糖3h后,低聚木糖得率达到35.5%,而木糖得率仅为1.5%,低聚木糖与总糖的比值达到95.8%,随着酶解时间的延长,低聚木糖不会被降解。     

嗜单宁管囊酵母木糖酒精发酵的研究

综合利用丰富、廉价且可再生的农作物秸秆资源生产酒精的研究已经渐渐成为全球范围的热点之一。文章研究了嗜单宁管囊酵母木糖酒精发酵的发酵性能,分离、筛选、驯化培养出一株高效木糖酒精发酵菌株 g-13,在最适条件下其木糖酒精发酵的转化率为 0.446 g/g(酒精/消耗的糖),为发酵秸秆纤维水解液中的戊糖生产燃料酒精提供菌种支持。     

重组大肠杆菌HW2利用甘油高产1,2-丙二醇的研究

对一株能在厌氧条件下高效代谢甘油的大肠杆菌突变株HW2进行基因工程改造,使其能利用甘油合成1,2-丙二醇。首先,敲除HW2中与丙酮醛脱毒途径相关的三个基因ald A、glo A、hch A和乳酸合成基因ldh A,得到菌株HWAGHL,并在甘油培养基I中厌氧培养。结果显示菌株HWAGHL代谢甘油的能力并没有明显减弱,培养120 h后能产0.013 g?L?1的1,2-丙二醇。在HWAGHL中单独过表达mgs A后,经72 h厌氧培养可得0.04 g?L?1的1,2-丙二醇,在HWAGHL中共表达gld A、dha KL(来自弗氏柠檬杆菌)、mgs A和yqh D(HWAGHL/p TH)后,经72 h厌氧培养可得0.48g?L?1的1,2-丙二醇。在菌株HWAGHL/p TH中过表达gld A和fuc O,1,2-丙二醇产量可分别提高18%和16%。最后,菌株HWAGHL/p TH在甘油培养基II中厌氧培养,72 h可得1.58 g?L?1的1,2-丙二醇,得率为0.20 g?g?1甘油。     

甘蔗渣水解液替代部分糖源生产细菌纳米纤维素的研究?

以甘蔗渣水解液替代部分糖源,比较研究了四株菌生产细菌纳米纤维素(Bacterial Nanocellulose, BNC)的情况。甘蔗渣水解液含96.5 g/L葡萄糖、35.5 g/L木糖,少量阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖,并含有9.2 g/L糠醛、14.0 g/L乙酸,以及少量的5-羟甲基糠醛和甲酸。含体积比15%和10%水解液的培养基对KomagataeibacterxylinusDHU-HL-Z1、DHU-HL-Z2和DHU-HL-Z3生产BNC有促进作用,而ATCC 23770菌株对水解液最不耐受,BNC产量无明显增益。在含10%水解液的培养基中,DHU-HL-Z2和DHU-HL-Z1两个菌株的粗BNC转化率分别为0.61g/g和0.58g/g,显著高于(p<0.05)菌株DHU-HL-Z3和ATCC 23770。     

重组大肠杆菌的构建及利用木糖生产木糖醇的研究

xylB基因失活可以降低木酮糖的磷酸化,使木糖还原为木糖醇而不进入PPP途径。利用Red重组技术构建xylB缺失大肠杆菌DxylB/E.coli BL21(DE3)可以提高木糖醇的产率。通过PCR克隆得到来自Neurospora crassa的木糖还原酶基因xr,将该基因与载体p ET30a(+)连接构建表达质粒p ET30a-xr;PCR克隆得到来自E.coli K-12的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6-PGDH)基因gnd和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)基因zwf,依次与双启动子原核表达载体p CDFDute-1连接构建表达质粒p CDFDuet-gnd-zwf;将上述构建好的两个重组质粒同时转化到DxylB/E.coli BL21(DE3)宿主体内。经异丙基-?-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得分子量约为38、51、54 k D的三种蛋白,酶活测定显示,重组菌种XR的比酶活为7.25 U×mg-1,6-PGDH的比酶活为2.26 U×mg-1,G6PDH的比酶活为1.31 U×mg-1。5 L发酵罐发酵结果显示,xylB基因敲除可以提高木糖醇的产率,含NADPH再生系统的菌株木糖醇的体积产率是1.04 g×(L×h)-1,比只含有木糖还原酶的重组菌株0.88 g×(L×h)-1高24.32%,为后续工业化利用大肠杆菌生产木糖醇奠定了基础。     

异源转氢酶NNT对酿酒酵母木糖代谢的影响

表达有毕赤酵母木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的重组酿酒酵母,能代谢木糖.但是XR和XDH分别偏好辅酶NADPH和NAD⁺,造成辅酶的不平衡和副产物的积累,所以重组酿酒酵母利用木糖产生乙醇的效率很低.转氢酶可以催化辅酶NADPH和NADH之间的相互转化,因此本实验将黑曲霉的转氢酶基因NNT转入到重组酿酒酵母中,通过实验确定了NNT基因的表达蛋白在酵母细胞内定位于线粒体中,NNT基因分别用pPGK1、pCCW12和pHXT7启动子进行表达,在微好氧的木糖发酵条件下,NNT基因的导入使酿酒酵母甘油产量下降,乙醇产率提高,在由pCCW12和pHXT7表达NNT基因的重组酿酒酵母中,木糖醇产率分别下降86.3%和49.3%,乙醇产率提高16.7%和12.7%,说明转氢酶NNT的存在改善了木糖代谢的辅酶不平衡,提高了乙醇的转化率.     

乙炔氢氯化过程中铜基催化剂的制备及催化性能

采用球形活性炭为载体,制备了用于乙炔氢氯化反应的载Cu催化剂, 并采用TEM进行了表征。在常压固定床反应器中考察了溶剂、酸洗液、Cu的负载量、焙烧温度对Cu/C催化剂性能的影响。结果表明, 以1 mol/L盐酸为溶剂,1 mol/L H₃PO₄为活性炭酸洗液,Cu的负载量为15%,焙烧温度为500℃时,该催化剂具有较高的分散度和反应活性。空速180 h^-1、V(HCl)/V(C₂H₂)=1.1、Cu的负载量为15%、温度180℃时,乙炔氢氯化反应的转化率可达68%以上, 氯乙烯选择性不低于99.5%,同时具有较好的稳定性; 在空速为540 h^-1时, 其催化活性会因活性组分的团聚结晶而降低。     

大肠杆菌中核黄素的生物合成途径改造及生产

利用PCR技术从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)中扩增出3.5 kb的核黄素操纵子,将其分别连接到不同拷贝数的表达载体pSC101、p15A、pBR322,得到重组载体pSC101-BSrib、p15A-BSrib和pBR322-BSrib,并分别转化到大肠杆菌(Escherichia coli K-12 MG1655)。对含有核黄素操纵子的重组大肠杆菌进行摇瓶发酵,结果表明其核黄素合成能力随着质粒拷贝数的增加而增强。随后对E. coli K-12 MG1655 ECX3菌株的诱导剂IPTG浓度和发酵温度进行了优化。结果显示,0.1 mmol·L^-1 IPTG和42 ℃为核黄素生产的最适宜条件。在此条件下,菌株ECX3在LB培养基中核黄素产量达到251.4 mg·L^-1。最后,通过无痕基因操作技术,减弱了工程菌株ECX3核黄素激酶/黄素腺嘌呤二核苷酸氨酰转移酶(ribF)的表达以减少核黄素转化为FMN和FAD,摇瓶中工程菌株ECX4的核黄素产量提高到292.3 mg·L^-1。     

嗜盐单胞菌利用乙酸盐合成PHB的研究

首先测试了嗜盐单胞菌Halomonas sp.TD1.0对乙酸钠的耐受性,结果显示乙酸钠浓度由25 g·L^-1提高到100 g·L^-1时对TD1.0生长的抑制率只有45.8%。在摇瓶培养中,TD1.0在36 h内消耗完27.3 g·L^-1乙酸钠,细胞干质量达到9.6 g·L^-1,其中PHB质量分数为61%,表明该菌株具有很好的高浓度乙酸钠耐受性和利用乙酸合成PHB的特性。随后为进一步提高乙酸钠的利用速度,在TD1.0中分别用高拷贝和低拷贝表达载体表达了来自枯草芽孢杆菌的乙酰辅酶A合成酶基因acs,结果显示,含有高拷贝表达质粒的菌株TD-PN59的乙酸盐平均利用速率为0.91 g·L^-1·h^-1,比 TD1.0提高了19.7%。TD-PN59的细胞干质量和PHB质量分数分别达到9.98 g·L^-1和65%,PHB产量达到6.49 g·L^-1,比TD1.0提高了约10.8%。在以葡萄糖和乙酸钠为混合碳源(10 g·L^-1 Glu和10 g·L^-1 NaAC)的培养基中,利用低拷贝载体表达acs的TD-PN85菌株的乙酸钠利用速率显著高于TD1.0,并且在一定程度上缓解了碳分解代谢物阻遏现象(CCR),促进了葡萄糖和乙酸钠的共利用。     

过表达谷氧还蛋白基因GRX5提高酿酒酵母乙酸耐性

利用可再生的纤维素原料生产燃料乙醇是国内外研究的热点。但纤维素原料一些预处理过程产生的乙酸对酿酒酵母细胞生长和乙醇发酵产生强烈抑制,因此,提高酿酒酵母细胞的乙酸耐受性是提高纤维素乙醇发酵效率的重要手段。本文研究了谷氧还蛋白家族中GRX5p的编码基因的过表达对酿酒酵母在乙酸胁迫条件下细胞生长和发酵性能的影响。结果表明,过表达GRX5的重组菌株在含有5 g·L^-1乙酸的平板中生长优于对照菌株;在含有5 g·L^-1乙酸的培养基中进行乙醇发酵,过表达GRX5的重组菌株可在48 h基本消耗培养基中所有的葡萄糖,发酵周期比对照菌株缩短了12 h。过表达GRX5菌株的乙醇生产强度为0.897 g·L^-1·h^-1,比对照提高了28.5%。代谢物分析结果表明,过表达GRX5的重组菌株可产生更多的保护性物质海藻糖和甘油,有利于增强菌株胁迫耐受性。     

铈锆固溶体担载的镍催化剂对CO2甲烷化性能研究

采用共沉淀法制备了Ce_xZr_1-xO₂固溶体作为催化剂载体,采用柠檬酸络合法将镍负载于Ce_xZr_1-xO₂载体上得到Ni/Ce_xZr_1-xO₂催化剂,利用X射线衍射（XRD）、N₂吸附-脱附（N₂-BET）、程序升温脱附（TPD）、程序升温还原（TPR）等技术对催化剂进行表征,在常压微型固定床反应器上测试了CO₂甲烷化的性能,考察了n（Ce）/n（Zr）、镍含量对催化性能的影响。研究发现制备的催化剂具有优异的活性,在常压和空速15 000 mL·g^-1·h^-1条件下,反应温度200℃时,12% Ni/Ce_0.25Zr_0.75O₂催化剂（负载量为质量分数,下同）CO₂的转化率达74%,CH₄选择性为100%。12% Ni/Ce_0.25Zr_0.75O₂催化剂300 h的稳定性测试结果显示其具有较高的抗烧结性能。催化剂的优异活性归因于采用了新的负载方法--柠檬酸络合法负载活性组分镍,该法实现了镍的高分散和催化剂的大的比表面积。     

光催化辅助高浓度臭氧循环工艺降解对氯苯酚及协同机理

针对臭氧(O3)降解对氯苯酚(4-CP)中效率有限且尾气排放高的问题,采用光催化辅助高浓度臭氧循环工艺并对TiO2浓度、循环气量以及pH值等因素进行研究,结合对苯醌变化及猝灭剂试验分析其协同机理.循环气量为2.0 L·min-1,TiO2投加量为250 mg·L-1时,O3/TiO2/UV体系的降解动力学系数为0.29...     

吡唑醚菌酯的合成研究

以邻硝基甲苯为原料,经还原、酰化、甲基化和溴化四步反应得到N-甲氧基-N-2-溴甲苯氨基甲酸甲酯,然后与1-(4-氯苯基)-3-吡唑醇反应得到吡唑醚菌酯。在优化后的反应条件下,目标化合物纯度大于98.4%(LC),总收率大于56.7%(以邻硝基甲苯计),其结构经¹H-NMR和MS分析确证。该工艺具有反应条件温和,产品收率高等优点,适合工业化生产。     

毛细管微反应器降解亚甲基蓝废水试验研究

为提高Fe²⁺活化过硫酸钠(SPS)降解亚甲基蓝(MB)效率,设计了一种毛细管微反应器。以磁力搅拌和静置反应系统作为对比,研究了在毛细管微反应器中MB与硫酸亚铁(FeSO₄)混合液pH值、FeSO₄浓度、SPS浓度、进料流量以及毛细管长度对MB降解率的影响。结果表明:随着MB与FeSO₄混合液的pH值的增大,MB降解率先升高后降低;随着FeSO₄浓度的增加,MB降解率先升高后降低;当SPS浓度从0.2 mmol·L^-1增加到1.8 mmol·L^-1时,MB降解率显著升高,继续增加SPS浓度,MB降解率缓慢上升。随着进料流量和水浴温度的增加,MB降解率升高;随着毛细管长度的增加和进料流量的减小,MB降解率升高。在相同反应条件下,毛细管微反应器氧化降解性能优于磁力搅拌和静置反应系统。当MB浓度为0.2 mmol·L^-1,MB与FeSO₄混合液pH值为3、FeSO₄浓度为1.4 mmol·L^-1、SPS浓度为1.8 mmol·L^-1、进料流量为1 mL·min^-1、毛细管长度为6.32 m时MB降解率可达85.92%。     

内循环式铁碳微电解/H2O2耦合工艺处理多晶硅有机废水

针对铁碳微电解反应中填料易板结及处理效率低等问题,通过增加内循环装置改进反应器结构,同时将铁碳微电解与H₂O₂进行工艺耦合,用于处理多晶硅有机废水,考察了Fe-C投加量、初始pH值、H₂O₂投加量、反应时间等工艺条件对COD去除率的影响,并通过响应面法优化了工艺条件。结果表明,各工艺条件对多晶硅有机废水COD去除效果的影响大小为：铁碳投加量>反应时间>H₂O₂投加量>初始pH值,其最适宜工艺条件为：铁碳投加量250 g·L^-1,初始pH值2.8,H₂O₂投加量112 mL·L^-1,反应时间83 min,该反应条件下COD的去除率为71.26%。铁碳/H₂O₂降解多晶硅有机废水COD的动力学回归方程为Y=0.5273X-0.6347,降解COD的速率常数为0.527 3 min^-1。