治疗性双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法首先通过计算质粒拷贝数,检测工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在传代过程中的遗传稳定性,通过摇瓶培养确定培养基组成,再在30L发酵罐内,通过改变培养基成分、培养时间、补料方式,确定最佳发酵参数。并将确定的最佳发酵参数应用于50L发酵罐连续3批中试规模的发酵,同时考察在发酵培养过程中质粒稳定性和超螺旋质粒DNA的比例。结果工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在连续传代30次后,质粒拷贝数保持稳定。确定最佳发酵参数为以甘油为碳源的培养基培养,梯度恒速流加方式补料,培养时间为10h。通过3批稳定发酵,最终可获得湿菌58.0~71.8g/L,质粒含量可达到1.11~1.58mg/g菌,超螺旋质粒DNA的比例达93%以上。结论已建立了稳定的双质粒HBV DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。     

重组HIV-1 DNA疫苗工程菌中试发酵工艺的优化

目的优化重组HIV-1DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法优化质粒转化条件,制备工程菌Jm109/pVAX1-MEGp24种子液,连续传30代,检测其遗传稳定性;优化培养基成分、补料基质、补料方式和培养时间,确定最佳发酵参数;并应用最佳发酵参数,于50L发酵罐进行3批中试规模的发酵,考察在发酵培养过程中质粒的稳定性和超螺旋质粒的比例。结果工程菌在连续传代30次后,质粒拷贝数基本保持稳定;最佳发酵参数为:采用以甘油为碳源的培养基,以梯度恒速流加方式补料,培养时间13h;通过3批稳定发酵,最终可获得湿菌67.0～68.6g/L,质粒含量可达1.62～1.73mg/g菌,超螺旋质粒的比例达93%以上。结论已建立了稳定的重组HIV-1DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。     

CTAB法制备超螺旋质粒DNA

研究了基因治疗用载体质粒DNA的一种非色谱的大规模纯化方法-CTAB沉淀法,并对其进行了工艺优化. 首先采用高纯过滤介质CelPure去除大量杂质,并利用CTAB浓度梯度溶液研究了不同形式DNA(超螺旋质粒DNA、切口质粒DNA、线性质粒DNA、染色体DNA)沉淀能力的差异,选择性地从蛋白质、RNA及其他形式DNA中提取超螺旋质粒DNA. 针对含有pcDNA3的DH5a菌株,确定CTAB完全沉淀超螺旋质粒DNA的浓度为2.0 g/L,由NaCl对不同沉淀的溶解能力,确定溶解沉淀的最优盐浓度为0.75 mol/L. 用此方法得到的超螺旋质粒DNA的纯度达90%以上,收率为78.94%. RNA、蛋白质残量以及内毒素均符合药品质量标准要求. CTAB对质粒DNA的沉淀效果与质粒DNA的初始浓度有关,并且超螺旋质粒DNA浓度的降低与CTAB的添加量呈一定的线性关系. 超螺旋质粒的分子量越小越不易被分离,并且结构特性比分子量在分离过程中更据主导作用.     

日本血吸虫核酸疫苗质粒适宜宿主菌的筛选及其发酵条件的优化

目的筛选二价日本血吸虫核酸疫苗质粒的适宜宿主菌,并对其发酵条件进行优化。方法通过综合考察细胞干重、质粒DNA产量及工程菌传代的质粒稳定性等参数,确定适宜宿主菌及其相适应的发酵培养基碳源、氮源和磷酸盐类型;进一步通过中心组合设计响应面试验,优化发酵培养基,并对优化的发酵培养基进行实验验证。结果确定适宜宿主菌为E.coliDH5α,优化的发酵培养基(m/v)为:NaCl1.0%,Yeast Extract1.0%,磷酸盐0.3%[其中m(K2HPO4)∶m(KH2PO4)=1∶4],甘油1.68%,牛肉汁2.28%,豆饼汁4.21%。在此发酵条件下,菌体干重由原来的1.57mg/ml增长至5.68mg/ml,质粒DNA产量由原来的3.94μg/ml增长至36.52μg/ml。结论已筛选出日本血吸虫核酸疫苗质粒适宜宿主菌,并优化了其发酵条件,明显提高了质粒DNA产量,具有大规模发酵生产应用价值。     

治疗性双质粒HBV DNA疫苗的纯化与检定

目的研究双质粒HBVDNA疫苗(pS2.S和pFP)的纯化工艺,并建立质控标准。方法首先对两工程菌(DH5α/pS2.S和DH5α/pFP)的高效发酵菌体采用碱裂解法进行质粒初提;然后通过三步柱层析(依次为分子筛层析、亲和层析、阴离子层析)进行质粒纯化,并检测质粒含量、超螺旋比例、内毒素等,最后对终产品质粒溶液进行全面质量检定。结果质粒初提液通过分子筛层析后,去除了大量的RNA、宿主DNA、内毒素等,再经亲和柱纯化后获得了高比例的超螺旋质粒DNA,达95%,最后经阴离子柱层析有效去除内毒素,并浓缩了质粒,质粒得率为0.9～1.1mg/g菌,质粒总回收率达78%。三批终产品全面质量检定均符合规定。结论建立了稳定的双质粒HBVDNA疫苗(pS2.S和pFP)的纯化工艺及质量控制标准,为进一步研究奠定基础。     

大肠杆菌hCG核酸疫苗质粒扩增营养条件研究

采用摇瓶实验考察了营养条件对大肠杆菌hCG核酸疫苗质粒含量的影响。结果表明,甘油是质粒DNA生产的最佳碳源;C/N比对质粒DNA含量影响明显。向改良的PDM培养基中添加3 g.L-1的柠檬酸钠,可以降低糖酵解途径的代谢通量,使质粒含量达到11.73 mg.L-1,提高了20%。氟化钠是糖酵解途径的抑制剂,在菌体生长8 h后,向改良的PDM培养基中添加浓度为120 mg.L-1的氟化钠,培养后质粒DNA含量为12.09 mg.L-1,提高了29%。进一步研究发现乙醇对质粒DNA含量影响显著,在改良的PDM培养基中添加2 g.L-1的乙醇,可使质粒DNA含量达到12.94 mg.L-1,提高了32%。     

惰性吸附载体固态发酵细菌纤维素的研究

惰性载体吸附固态发酵是一种新型的固态发酵方式。以聚氨酯塑料泡沫为吸附载体,对木醋杆菌(Acetobacter xylinum)CGMCC No.1.1812吸附载体固态发酵过程中影响纤维素产量的因素及发酵过程进行了初步研究。结果表明,在固液比为1∶16,载体堆料高度为3 cm,初始葡萄糖质量浓度为20 g/L时,72 h发酵,细菌纤维素产量可达到4.86 g/L,整个发酵周期的容积生产率可达到1.62 g/(L.d)。与常规液态静置发酵相比,发酵产量同期提高了5.65倍,一个发酵周期的容积生产率提高了3.16倍。     

响应面分析法优化蛹虫草液体发酵培养基

目的运用响应面分析法对蛹虫草液体发酵培养基进行优化,以提高蛹虫草发酵液中抗肿瘤活性物质的含量。方法以对肝癌细胞抑制率为指标,首先进行单因素试验优选出培养基中最佳氮源及其浓度以及葡萄糖和磷酸二氢钾(KH_2PO_4)最佳浓度;再采用响应面分析法确定关键因素之间的配比。结果蛹虫草最佳液体发酵培养基为:葡萄糖浓度20.22 g/L,蛋白胨浓度17.57 g/L,KH2_PO_4浓度0.92 g/L,硫酸镁浓度0.5g/L,在该条件下,肝癌细胞抑制率为70.121%,与模型预测值(70.938%)相接近。结论运用响应面分析法对蛹虫草液体发酵培养基进行了优化,从根本上提高了各活性物质的产量,对后续蛹虫草抗癌活性的研究具有重要意义。     

一种靶向治疗肺癌的TV-BIKDD质粒的纯化及检定

目的提取、纯化靶向治疗肺癌的质粒TV-BIKDD,并进行质量检定。方法采用碱裂解法对工程菌DH5α/TVBIKDD菌体进行质粒初提,通过两步整体柱层析(离子柱层析和疏水柱层析)进行质粒纯化,并检测质粒含量、DNA超螺旋比例;用该方法连续纯化3批以超螺旋质粒DNA为样品的溶液制剂,对纯化后的质粒进行质量检定。结果质粒初提液经离子柱层析纯化后,去除了大量的RNA和蛋白质,再经过疏水柱层析纯化,最终获得的质粒DNA超螺旋比例为95.21%以上,质粒总回收率为78%。纯化后的3批溶液制剂全面质量检定结果均符合美国FDA标准以及我国人基因治疗用产品的技术指导原则规定。结论建立了稳定的TV-BIKDD质粒的纯化工艺,为进一步制备临床药用级样品的规模化工艺研究奠定了基础。     

桔青霉产美伐他汀发酵条件优化和小罐放大

首先研究了不同碳、氮源,无机盐,初始pH值和接种量等因素对桔青霉HD-32-2产美伐他汀生产能力的影响,然后着重对4种发酵培养基组分(葡萄糖,麦牙糖,黄豆饼粉和磷酸氢二钾)进行正交试验,形成了最优的发酵培养基。与最初的发酵培养基相比,在最优发酵培养基上发酵水平提高了3倍,达到了986 mg/L,并在15 L小型发酵罐上进行了放大比较研究,进一步说明了优化后培养基具有明显的提高美伐他汀发酵水平的能力。     

治疗用质粒DNA的纯化工艺

目的探索适合大规模生产治疗用质粒DNA的纯化工艺。方法采用中空纤维柱收菌、碱裂解,再应用中空纤维柱浓缩质粒,经分子筛、亲和、离子交换等层析分离纯化质粒DNA,并应用凝胶电泳、PCR、核酸蛋白检测仪、BCA蛋白检测试剂盒和内毒素检测试剂盒对所纯化的质粒DNA进行全面检定。结果所获得的超螺旋质粒DNA达到样品总质粒的91.2%;质粒DNA总纯度为1.8;内毒素含量小于10EU/mg;几乎检测不到蛋白质残留,未检出基因组DNA残留。各项指标均符合有关质量标准。结论所采用的纯化工艺省时省力,制备的质粒DNA纯度高,适用于大规模生产治疗用质粒DNA。     

发酵生产环氧琥珀酸水解酶的研究

诺卡氏菌环氧琥珀酸水解酶是胞内酶,提高发酵过程酶的产量可以从提高菌体质量浓度和提高比酶活两方面入手。菌体质量浓度和培养基中葡萄糖的质量浓度有关,但葡萄糖质量浓度过高对菌体的生长会有抑制作用,培养基中初始葡萄糖质量浓度为5g/L,在消耗殆尽后以1.3g/(L·h)的速度流加,可以将菌体质量浓度提高到6g/L以上。环氧琥珀酸采用两段式流加,流加结束时比酶活达到3000u/g以上,菌体质量浓度达到了8g/L,与原产酶水平1200u/g和菌体质量浓度4g/L相比有较大的提高。     

培养基营养调控对小球藻Chlorella protothecoides胞内生化成分积累的影响

目的研究调控异养培养基中碳源和氮源浓度对小球藻Chlorella protothecoides(C.protothecoides)胞内生化成分积累的影响。方法分别以葡萄糖为碳源(尿素初始浓度为3 g/L,葡萄糖浓度分别为10、20、30、40、50 g/L)、尿素为氮源(葡萄糖初始浓度为30 g/L,尿素浓度分别为3.00、0.00、0.15、0.30、0.45、0.60 g/L),避光培养小球藻细胞,收集藻液,制备冻干藻粉。采用傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscgy,FTIR)测定小球藻胞内蛋白质、油脂和碳水化合物的变化。结果当培养基葡萄糖浓度为30 g/L,尿素浓度为3 g/L时,蛋白质吸收峰强度最大,相对含量较高,碳水化合物次之,油脂含量最低;与氮充足(3.00 g/L)条件下相比,氮缺失(0.00 g/L)条件下,蛋白质吸收峰强度骤然降低43.22%,油脂增高1.41倍,碳水化合物提高6.04%。结论培养基中不同碳、氮水平可实现胞内不同大分子组分(油脂、蛋白质和碳水化合物)产量的调控,满足不同层次的工业需求。     

培养条件对产朊假丝酵母合成谷胱甘肽的影响

考察了培养基组成,培养条件对产朊假丝酵母生长和谷胱甘肽合成的影响,包括不同碳源,氮源及其浓度,pH,装液量,接种量等。确定以葡萄糖、磷酸氢二铵作为碳源和氮源,较佳浓度分别为20g/L和3g/L,接种量为10％,在20 g/L 的糖 浓度时获得的谷胱甘肽总量可达74mg/L,胞内含量为1.4％左右。此外还研究了三种前体氨基酸和ATP的加入量,加入时间对发酵的影响。     

葡萄糖和木糖双底物生物合成2,3-丁二醇的条件优化

针对利用葡萄糖和木糖合成2,3-丁二醇的Klebsiella pneumoniae XJ-Li菌,优化培养基组成与发酵条件,围绕五、六碳糖共代谢的特点,探讨简单可行的代谢调控方法. 结果表明,60 g/L葡萄糖和40 g/L木糖为碳源,5.75 g/L NH4H2PO4为氮源,pH值维持在5.5,培养温度38℃, 2,3-丁二醇浓度可达19.24 g/L. 确定了pH值调控和外源添加维生素C的调控方式,通过调节发酵过程中pH值于5.5左右,使2,3-丁二醇的产量提高了16.4%;添加60 mg/L维生素C调节培养基的氧化还原状态,可使2,3-丁二醇的产量提高44.3%,批式发酵48 h, 2,3-丁二醇终浓度可达33.47 g/L.     

碱性纤维素酶基因在巴氏毕赤酵母中的表达及重组酵母菌发酵工艺的优化

目的克隆碱性纤维素酶基因,构建酵母整合型表达质粒,在巴氏毕赤酵母中表达,并对重组菌的发酵工艺进行优化。方法应用PCR技术从嗜碱性芽孢杆菌ATCC21833中扩增碱性纤维素酶基因,克隆至酵母整合型表达载体pGAPZαA中,构建重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833,并转化至巴氏毕赤酵母GS115。通过单因素实验及正交实验,确定重组酵母的最佳发酵培养基。在20L发酵罐中进行高密度发酵,观察碳源对批式发酵的影响,并检测在4种流加方式(连续恒速流加、间歇匀速流加、间歇递减流加、维持底物浓度流加)下的菌体干重及发酵液中的酶活性。结果重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833经酶切及DNA测序证明构建正确,其基因序列与嗜碱性芽孢杆菌KSM-635的碱性纤维素酶基因序列一致。最佳发酵培养基组成为6%葡萄糖、2%硫酸铵、12g/L磷酸二氢钾。碳源浓度对于重组酵母菌体生长及产酶至关重要。SDS-PAGE表明表达产物的相对分子质量约为103000。维持底物浓度的流加方式可获得最高的菌体干重(29.8g/L)及酶活力(24U/ml)。结论已成功构建了表达碱性纤维素酶的巴氏毕赤酵母工程菌,并确定了维持底物浓度的流加方式为最佳发酵方式。     

Optimization of medium components for D-ribose production by transketolase-deficient <Emphasis Type="Italic">Bacillus subtilis</Emphasis> NJT-1507

Statistical experimental designs were used to optimize the composition of culture media for the production of D-ribose by Bacillus subtilis. A fractional factorial design 2^(5-2) was used to determine medium components that significantly affected D-ribose production. The concentrations of glucose and (NH₄)₂SO₄ were the significant factors. Central composite design and response surface methodology were then used to estimate the quadratic response surface and determine the factor levels for maximum production of D-ribose. Finally, the optimal medium composition was obtained (g/L): glucose, 172.75; (NH₄)₂SO₄, 13.2; yeast powder, 4; corn steep liquor, 8 and MnSO₄, 0.5. This optimization strategy increased D-ribose production from 73.21 g/L to 88.57 g/L, an increase of 22% compared with the original conditions. The D-ribose production yield to glucose concentration was also enhanced from 0.37 g/g to 0.52 g/g. Confirmatory experiments were also performed to demonstrate the accuracy of the model. Under the optimal medium using ammonia to control pH in a 5 L fermenter, the D-ribose yield was increased to 95.28 g/L after 3 days of cultivation at 37 °C.