大蒜中蒜氨酸酶的分离纯化及纯度测定

对大蒜中的蒜氨酸酶进行分离纯化以研究其酶学及光谱学性质。首次采用Sephacryl S-200凝胶柱对新鲜大蒜以及微波真空与真空联合干燥(MV/VD)大蒜中的蒜氨酸酶进行了一步分离纯化,并采用反相HPLC和SDS-PAGE电泳测定柱分离后新鲜大蒜的蒜氨酸酶和MV/VD大蒜的蒜氨酸酶的纯度。结果表明,经Sephacryl S-200凝胶柱一步分离的蒜氨酸酶可达很高的纯度,电泳结果显示达到电泳纯。采用Sephacryl S-200凝胶柱分离纯化后的蒜氨酸酶的纯度可以达到用于酶学性质和光谱学特性研究所需的纯度。     

洋葱中蒜氨酸酶的分离纯化

研究以国产红皮洋葱为原料,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-200HR柱层析、Con A-Sepharose4B亲和层析等处理,对洋葱中的蒜氨酸酶进行了分离和精提,得到纯化8.05倍、回收率49.5%的蒜氨酸酶,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳,测定洋葱中蒜氨酸酶亚基分子量为50.2ku。     

香葱中蒜氨酸酶的分离纯化及其酶学性质

对香葱中蒜氨酸酶进行分离纯化并研究其酶学性质。通过均浆、离心、硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52离子交换层析和Sephadex G200凝胶过滤层析技术分离纯化得到纯度较高的蒜氨酸酶,并利用SDS-PAGE电泳对其纯度进行鉴定。结果表明,经分离纯化可得纯化倍数为19.6倍的蒜氨酸酶,酶比活力为11.44U/mg,酶活回收率为32.1%,达到电泳纯,其亚基的分子质量约为54.5ku。纯酶的最适反应温度为45℃,最适pH7.0,以S-甲基-L-半胱氨酸亚砜为底物,蒜氨酸酶的Km为45.31mmol/L,Vmax为40.32μmol/(mg·min)。     

大蒜中蒜氨酸酶的氨基酸组成分析和热力学研究

本文对首次采用SephacrylS-200凝胶柱从新鲜大蒜中分离纯化出来的蒜氨酸酶的氨基酸组成进行了分析,并对蒜氨酸酶的催化反应表观活化能和热失活动力学进行了研究。结果表明,蒜氨酸酶中酸性氨基酸的含量比较高,其中Asp含量最多,摩尔百分含量达到15.51%;蒜氨酸酶催化反应在较低温度下即可进行且蒜氨酸酶是不耐高温的酶类。     

绿色木霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

针对绿色木霉AS3.3711产生的β-葡萄糖苷酶组分,先后运用包括乙酸铵沉淀、透析、Sephadex G-150葡聚糖凝胶柱层析在内的一系列分离纯化技术对该纤维素酶进行纯化,得到β-葡萄糖苷酶纯化组分,并对该酶的酶学性质进行研究。纯化后酶液的蛋白质量浓度为8.12 mg/mL、酶活力为4.08 U/mL,纯化倍数达到18.48,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）测定分子质量为66.0 kD。绿色木霉β-葡萄糖苷酶在酸性条件下稳定性良好,最适pH值为5.0;在温度60～70 ℃能长时间保持较高酶活力,最适反应温度为60 ℃。金属离子中,Ca2+、Mg2+、K+对绿色木霉AS3.3711 β-葡萄糖苷酶活力起到促进作用,Ca2+促进作用最强;而Zn2+、Fe3+对该酶有抑制作用,Ag+、Cu2+、Hg2+重金属离子使β-葡萄糖苷酶几乎丧失了全部活性。     

超声波条件下蒜氨酸酶性质研究

对新鲜大蒜中的蒜氨酸酶进行分离、纯化,研究超声波条件下已纯化的蒜氨酸酶的酶学性质。研究结果表明,最佳超声波作用条件为频率135 kHz、功率110 W。在该条件下,蒜氨酸酶的最适温度35℃,最适pH 6.5,在20～40℃温度范围酶活性较稳定;Na+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+对蒜氨酸酶的活性有激活作用,K+、Mg2+、Cu2+抑制酶的活性;0.025 mmol/L外源PLP和0.5 mmol/L L-半胱氨酸对蒜氨酸酶的活性有促进作用。     

蜂王浆主蛋白1低聚体的分离纯化及其圆二色谱分析

蜂王浆主蛋白1（major royal jelly protein 1,MRJP1）是蜂王浆主蛋白家族中最重要的成员之一,MRJP1存在单体和低聚体两种形式。为了研究MRJP1低聚体的二级结构信息,首先利用ToyoScreen GigaCap Q-650M离子交换柱从新鲜蜂王浆中纯化出MRJP1低聚体,经分析超速离心和高效液相色谱-串联质谱技术鉴定其为MRJP1低聚体后,再通过圆二色谱技术检测MRJP1低聚体在不同浓度Ca2+条件下（10、50、200 mmol/L）二级结构的变化情况,并测定其变性温度。结果表明：该分离方法可以一步纯化出MRJP1低聚体,MRJP1低聚体的二级结构中β-折叠占比最高（55%左右）,其次是无规卷曲（20%左右）和α-螺旋（15%左右）,β-转角（10%左右）含量最低;MRJP1低聚体的变性温度为55 ℃。实验提出了MRJP1低聚体新的纯化方法及其二级结构的基本信息。     

耐高温β-半乳糖苷酶的分离纯化与酶学性质分析

为从嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)XG24 发酵液中纯化到β- 半乳糖苷酶,并对酶学性质进行研究,利用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析和Sephadex G-75 分子筛凝胶过滤层析等方法进行分离纯化。结果表明：经过系列步骤纯化后,酶纯度提高了54.5 倍,回收率20.4%,酶比活力达32.7U/mg。以邻- 硝基酚-D- 半乳糖吡喃糖苷(ONPG)为底物,研究β- 半乳糖苷酶的酶学性质。最适pH6.5,最适作用温度65℃。此菌株产β- 半乳糖苷酶在70℃以下和pH4.0～8.0 范围内具有较好的稳定性;Mg2+、Mn2+、Fe2+和Co2+ 对此酶有明显激活作用,而Cu2+、Ag+、Hg2+ 几乎完全抑制酶活性。以ONPG 为底物酶的Km 值为4.32mmol/L。SDS-PAGE 和凝胶过滤层析测得酶蛋白为单肽链蛋白,表观分子质量64kD。因此,嗜热脂肪芽孢杆菌XG24 β- 半乳糖苷酶在乳制品工业中具有潜在的应用价值。     

黑豆脂氧合酶的制备及其酶学活性的鉴定

从黑豆种子中分离纯化1 种黑豆脂氧合酶--bsLOX,对其酶学活性及降解花色苷等性质进行初步研究。采用缓冲液抽提、硫酸铵沉淀、透析、阳离子交换层析及凝胶层析等方法纯化出具有β-葡萄糖苷酶活性的bsLOX;分别以亚油酸钠和对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside,pNPG）为反应底物鉴定bsLOX的脂氧合酶活性和β-葡萄糖苷酶活性。从黑豆种子中纯化获得的bsLOX在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE）图谱显示单一条带,分子质量约为95 kD。酶活性分析表明,纯化的bsLOX以亚油酸钠为底物时,酶活力为13 U/mL;当以pNPG为底物在405 nm波长处检测到了对硝基苯酚的生成,从而推测bsLOX具有β-葡萄糖苷酶活性。高效液相色谱实验结果表明bsLOX可以降解花色苷（矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷）为花色素（矢车菊素、矮牵牛素）。由于降解作用不完全,继而发现花色素能抑制bsLOX的酶活性。bsLOX是黑豆中的一种兼具β-葡萄糖苷酶功能的蛋白质,而花色素可能是天然的bsLOX抑制剂。     

冻藏条件下魔芋葡甘聚糖降解产物对肌原纤维蛋白结构的影响

为了研究魔芋降解产物对肌原纤维蛋白冷冻保护的作用机制,以草鱼肌原纤维为研究对象,采用紫外光谱、傅里叶红外光谱和扫描电镜研究不同的魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan,KGM）降解产物对冷冻贮藏草鱼肌原纤维蛋白结构的影响。结果表明：随着贮藏时间的延长,肌原纤维蛋白的最大吸收波长呈红移,主要由酪氨酸产生,不同的冷冻保护剂均不能保护酪氨酸的暴露。α-螺旋和β-折叠为草鱼肌原纤维蛋白主要的二级结构,随着贮藏时间的延长,α-螺旋结构所占比例上升,β-折叠结构所占比例下降,β-转角和无规卷曲的含量变化不大。辐照降解KGM和酶解KGM均对草鱼肌原纤维蛋白的二级结构有保护作用,稳定α-螺旋和β-折叠所占比例;而蔗糖-山梨糖醇促进草鱼肌原纤维蛋白中α-螺旋结构形成,不利于β-转角结构。显微观察的结果显示,辐照KGM样品和酶解的KGM样品可以延缓蛋白分子的聚集,延缓蛋白出现多孔状结构,而蔗糖-山梨糖醇样品冻藏过程保持片层结构。     

Low-frequency and low-intensity ultrasound accelerates alliinase-catalysed synthesis of allicin in freshly crushed garlic

BACKGROUND: The well‐known chemically and therapeutically active compound allicin is formed in crushed garlic by the interaction of alliin with alliinase. In this study, low‐frequency and low‐intensity ultrasound was employed to accelerate the alliinase‐catalysed synthesis of allicin in freshly crushed garlic. RESULTS: The optimal conditions for improvement of the alliinase‐catalysed synthesis of allicin in freshly crushed garlic were found to be as follows: ultrasound intensity 0.4 W cm^?2, ultrasound frequency 50 kHz, enzymatic reaction temperature 35 °C and reaction time 30 min. Under these conditions the yield of allicin was increased by about 25.2% compared with the control without ultrasound. Alliinase in the freshly crushed garlic was purified by ammonium sulfate precipitation and gel filtration on a Sephacryl S‐200 column. The employed ultrasound increased the activity of the purified alliinase by about 42.8%, did not affect the enzyme's temperature optimum and improved its thermal stability. CONCLUSION: The results of this study indicated that the activity of alliinase in freshly crushed garlic might be enhanced by low‐frequency and low‐intensity ultrasound, thereby accelerating the alliinase‐catalysed conversion of alliin in garlic to allicin. Copyright © 2011 Society of Chemical Industry     

金属离子对蒜氨酸酶性质的影响

以新鲜大蒜为原料,采用硫酸铵分级沉淀法、PEG6000沉淀法、葡聚糖G-200柱层析法提取分离蒜氨酸酶,获得适宜蒜氨酸酶粗分离的条件为：4℃、pH6.5磷酸盐缓冲液浸提,20%的PGE6000盐析,2000×g离心30min。再采用SDS-PAGE电泳法鉴定其纯度,发现纯度是粗酶液的16.85倍,回收率为41.26%,蒜氨酸酶亚基的分子质量约为54.7kD。利用正交试验优化金属离子交互作用对蒜氨酸酶活性的影响,研究金属离子对蒜氨酸酶反应动力学及紫外-可见光谱的影响。结果表明：不同浓度的离子组合对蒜氨酸酶活性有显著的影响,Mn2+是影响蒜氨酸酶活性最重要的因素;不同离子交互作用最佳条件为：Mn2+ 浓度10mmol/L、Fe3+浓度10mmol/L、Ca2+浓度5mmol/L、辅助因子蔗糖浓度5mmol/L,此条件下蒜氨酸酶相对酶活性为155.59%。而10mmol/L的Cu2+能够显著抑制蒜氨酸酶的活性;以蒜氨酸为底物,测得蒜氨酸酶Km值为0.25mmol/L,Vmax为1.29μmol/min;紫外-可见光谱证实了辅基磷酸吡哆醛的存在,金属离子对蒜氨酸酶的激活与抑制机制可能是因为激活剂和抑制剂影响了蒜氨酸酶辅助因子5,-磷酸吡哆醛的结构以及其与蒜氨酸酶主链的结合,从而影响了蒜氨酸酶的活性。     

大蒜植株中蒜氨酸酶的纯化方法研究

以新鲜大蒜植株为原料,采用pH7.0的Na+/K+磷酸缓冲溶液浸提蒜氨酸酶,分别研究了硫酸铵沉淀法、聚乙二醇(PEG8000)沉淀法、超滤条件和SephadexG-75色谱柱对蒜氨酸酶的纯化效果。PEG8000沉淀法得到蒜氨酸酶的纯化倍数为5.42,硫酸铵沉淀法得到蒜氨酸酶的纯化倍数为0.60。最佳沉淀条件为:先加入PEG8000至其浓度达到15%(m/v),离心,上清液中继续加入PEG8000至终浓度为25%(m/v),收集沉淀。截留分子量为30ku的超滤膜,在0.1MPa下循环超滤两次,此时蒜氨酸酶纯化倍数为超滤前的1.20倍。SephadexG-75色谱柱可有效地分离蒜氨酸酶峰和杂蛋白峰。     

蒜氨酸酶的分离纯化及其动力学特性

采用 (NH4 ) 2 SO4 盐析、SephadexG 2 0 0凝胶过滤和ConA Sepharose亲和层析方法对蒜氨酸酶进行了部分纯化 ,并研究了其酶动力学特性 ,结果表明其最适反应温度为 3 0℃ ,最适pH值为6 2 4,以蒜氨酸为底物 ,最大反应速度Vmax =1 2 0u/mg(蛋白质 ) ,米氏常数 Km =6 0 2× 1 0 - 3mol/L。文中同时研究了抑制与激活剂对蒜氨酸酶活性的影响     

提高大蒜精油提取得率的酶调控技术

报道了通过调控蒜氨酸酶活性提高大蒜精油提取得率的方法,并初步确定了提取大蒜精油的最适工艺条件。实验结果表明其提取得率较常规方法提高2倍。     

Differential hydrolysis of alk(en)yl cysteine sulphoxides by alliinase in onion macerates: flavour implications

Intact cells of Allium spp have no odour, but when cells are disrupted, the enzyme alliinase (EC 4.4.1.4) hydrolyses the S-alk(en)yl sulphoxides (ACSOs) to produce pyruvate, ammonia and the many volatile sulphur compounds associated with flavour and odour. In onions, there are three main sulphoxides: methyl, propyl and 1-propenyl, which gives rise to onion's tear-producing effect. The relative proportions of these are a factor in determining the subsequent flavour. γ-Glutamyl peptides, which are biosynthetic intermediates to ACSOs, are also present in significant amounts, but their contribution to flavour is not known. There is little work on the reaction of alliinase in vivo. The hydrolysis of ACSOs by alliinase was studied in rapidly macerated bulbs at intervals between 5 s and 2 h. ACSO and γ-glutamyl peptide levels were measured by HPLC, and pyruvate levels were measured spectrophotometrically. Although the hydrolysis of propenyl cysteine sulphoxide (PrenCSO) was immediate and almost 100% between 5 and 20 s after bulb maceration, the hydrolysis of propyl cysteine sulphoxide (PCSO) and methyl cysteine sulphoxide (MCSO) was incomplete. After 5 s maceration, about 50% PCSO and MCSO remained and thereafter no further hydrolysis occurred. The levels of ACSOs and the extent to which they were hydrolysed were dependent on the cultivar and sulphur environment in which it was grown. The addition of pyridoxal phosphate cofactor enhanced the extent of MCSO and PCSO hydrolysis. Additional purified alliinase per se had no effect. Substantial hydrolysis of γ-glutamyl peptides also occurred after maceration, and this was unexpected. Levels of pyruvate product were between 15 and 25% of the expected amount from ACSO hydrolysis assuming a stoichiometric relationship. The incomplete hydrolysis of MCSO and PCSO, enhancement of activity by additional pyridoxal phosphate and non-stoichiometric production of pyruvate are evidenced that reaction inhibition of alliinase may be occurring in onion macerates. © 1998 Society of Chemical Industry.     

提高大蒜精油提取得率的酶调控技术

本文报道了通过调控蒜氨酸酶活性提高大蒜精油提取得率的方法,并初步确定了提取大蒜精油的最适工艺条件,实验结果表明其提取得率较常规方法提高2倍。     

乳状液的组成及油滴粒径对β-胡萝卜素生物接近度的影响

目的:研究乳状液中β-胡萝卜素的胶束化过程以及油滴粒径、油相含量和β-胡萝卜素质量分数对乳状液中β-胡萝卜素生物接近度的影响规律及可能机制。方法:采用静态体外消化法,以胶束化率为指标评估β-胡萝卜素的生物接近度。结果:肠消化阶段的前30 min是乳状液中β-胡萝卜素胶束化过程的重要阶段;在一定范围内,β-胡萝卜素的胶束化率(3.23%~10.87%)与乳状液油滴粒径(0.44~4.28μm)呈线性负相关;油相含量1%~20%范围内,β-胡萝卜素的胶束化率随油相含量增加呈"S"型增长趋势;β-胡萝卜素的胶束化率随其质量分数的增加(2~30 mg/100 g)先上升后降低,相应地胶束中β-胡萝卜素的绝对质量先上升而后进入平台期。     

旧金山乳杆菌与自然发酵燕麦酸面团发酵剂中β- 葡聚糖含量及其分子量的分布

主要研究3 种不同的燕麦酸面团发酵剂(旧金山乳杆菌发酵、30℃和35℃自然发酵)发酵过程中β-葡聚糖含量和分子量分布的变化。结果表明：35℃自然发酵的酸面团发酵剂中β-葡聚糖含量最高,30℃自然发酵居中,旧金山乳杆菌发酵最低;旧金山乳杆菌发酵的酸面团发酵剂的β-葡聚糖分子量分布与峰值分子量在发酵过程中基本不变,且分子量分布在55～2.5 × 104kD 的β-葡聚糖占41%,高于其他发酵剂;30℃自然发酵酸面团发酵剂中,分子量大于20kD 的β-葡聚糖的含量接近40%;35℃自然发酵的酸面团发酵剂中β-葡聚糖的分子量分布范围较广,且小分子量的β-葡聚糖含量较高。