啤酒污染乳酸菌PCR引物的设计与验证

根据细菌16SrDNA序列的特点,对啤酒中常见污染乳酸菌16SrDNA序列进行分析,设计合成了针对啤酒污染乳酸菌的特征引物。并用该引物对从啤酒厂分离到的7种乳酸菌进行了检测,PCR结果表明该引物能够准确检测到啤酒中常见的乳酸菌。     

啤酒污染乳酸菌PCR引物的设计

根据细菌16s rDNA序列的特点，通过对啤酒污染菌16s rDNA序列进行分析，设计合成了针对啤酒污染乳酸菌的引物，在16srDNA基因水平证明了该引物对乳酸菌的特异性，该引物的特异性是PCR检测技术在啤酒厂推广应用的前提，同时反映了16s rDNA在微生物鉴定中所起的重要作用。     

RAPD-PCR快速鉴定啤酒污染菌的研究

本研究主要评价RAPD-PCR技术在快速鉴定啤酒污染菌中的应用。首先评价了CTAB法和试剂盒提取DNA模板对RAPD指纹稳定性的影响以及乳酸菌专一性BP引物扩增的16SrDNA的5’末端740bp序列用于鉴定菌种的可行性,采用PCR产物直接测序鉴定分离的污染菌,构建标准污染菌库。对分离菌M-13的RAPD指纹聚类分析表明,相同来源的同一种菌能很好地归类在一起。根据建立的快速鉴定流程和初步确定的菌种相似性阈值(SCC),对8株分离菌的鉴定表明,RAPD-PCR技术是一项简单、快捷、可靠性强的鉴定技术,为研究啤酒酿造过程的污染菌提供了一个非常有用的快速鉴定工具。     

基于FemAB基因特异引物的动物双歧杆菌PCR检测方法的建立

分离和鉴定了两株双歧杆菌,通过16SrDNA通用引物扩增条带测序和非特异引物随机扩增法扩增条带测序推测其为动物双歧杆菌。随后使用以编码肽聚糖肽桥形成蛋白(Peptidoglycan bridge formation protein)FemAB基因为目的扩增片段设计的特异引物进行了扩增鉴定。结果表明,此特异引物对这两株动物双歧杆菌菌株扩增结果为阳性,其他对照菌株扩增结果为阴性,且扩增条带测序结果与预计一致。FemAB基因在PCR特异扩增法鉴定细菌种属中具有较好的分辨能力,并使用其建立了动物双歧杆菌PCR检测方法。本研究旨为应用FamAB基因鉴定细菌种属以及双歧杆菌属微生物的鉴定提供了数据参考。     

一种啤酒有害菌中的乳酸菌的PCR检测

本文对工厂送来的有害菌样品进行划线纯化后,分别命名为TJl、TJ2、TJ3、TJ4、TJ5、TJ6和TJ7,并制成冻存管保存于-70℃冰箱。从中挑选TJ2、TJ3采用PCR（PolymeraseChainKeac—tion）m进行了分子生物学的菌种鉴定—16srRNA菌种鉴定实验,经鉴定为乳酸菌属。使用乳酸菌特异性引物对上述有害菌进行鉴定。证明其引物LbHC一1／LbHC一2可以用于乳酸菌的检测。     

啤酒有害菌的PCR检测和SYBR Green实时PCR定量

啤酒有害菌是一些能在啤酒中存活并使啤酒的外观和风味发生改变的细菌,对其进行快速检测和定量是啤酒生产急待解决的问题。我们从华润雪花啤酒（中国）有限公司各工厂提供的样品中分离到28株啤酒有害菌,16S rDNA序列的系统进化分析表明,其中26个菌株属于乳杆菌属（Lactobacillus spp．）、1个菌株为明串珠菌属（Leuconostoc spp．）,1个菌株为片球菌属（Pediococcu sp．）。根据酒花（hop）抗性基因horA、horB和horC的保守序列设计了扩增这3个基因的PCR引物,用这些引物对28株啤酒有害菌进行了常规PCR检测,检出率分别为89％、79％和75％,用hor A—horC双引物进行检测,检出率为100％。用SYBR Green实时定量PCR技术,以horA基因为靶序列,建立了对啤酒有害菌的细胞数进行快速定量的新方法,用该方法测定的污染啤酒样品中有害菌的浓度与平板培养法相近。     

PCR技术在啤酒有害菌检测中的关键技术研究

本研究以16s rDNA 为基础设计引物,利用 PCR 技术和传统的培养方法检测污染菌株作了比较,研究结果表明使用 PCR 技术检测啤酒有害菌的优势,完成检测与鉴定,可以将传统的检测时间由5～7天缩短到3天。试验中还对使用 PCR 技术检测发酵液（高泡期和贮酒期）、成品酒的方法进行了设计和优化,并对使用电泳条带的 OD 值半定量判定合格标准进行了初步研究。     

聚合酶链式反应(PCR)技术鉴定啤酒腐败菌的最新进展

综述了PCR技术在啤酒腐败细菌鉴定方面的应用及最新进展 ;介绍了 3种PCR技术 ,特别讲述了利用这些技术对啤酒中乳酸菌的鉴定 ;并分析了PCR技术的局限性 ,对其应用前景进行了展望。     

利用16S rDNA序列分析鉴定一株产抗菌物质的微生物菌株

从桃子上分离纯化得到1株产抗菌物质的菌株,命名为fmb3菌,通过抑菌实验发现该菌对革兰氏阳性菌蜡样芽孢杆菌、革兰氏阴性菌大肠埃希菌和真菌扩展青霉等3种常见食品病原菌具有显著的抑菌效果。利用16SrDNA分析对该菌作了系统进化鉴定,首先提取fmb3菌基因组DNA,根据不同种属的细菌的16SrDNA序列两端的保守性设计通用引物,对fmb3菌16SrDNA片断进行PCR扩增,对扩增得到的目标片段测序,并且利用NCBIBLAST对测序结果进行比对,构建系统进化树进行分析,初步确定该菌属于枯草芽孢杆菌。     

PCR技术在酿酒中的应用

PCR技术即利用聚合酶链反应，进行DNA片段的体外扩增，可用于发酵过程的特定菌的检验和鉴定，该法快速、准确。PCR技术有特异引物PCR技术、RAPD-PCR技术和Nested-PCR几种。PCR技术在酿酒中可用于啤酒中的腐败菌的鉴定、对葡萄酒中苹果酸一乳酸发酵(MLF)的检测和控制以及对葡萄酒中生物胺的检测。(孙悟)     

Monitoring the lactic acid bacterial diversity during shochu fermentation by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis

The presence of lactic acid bacteria (LAB) during shochu fermentation was monitored by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and by bacteriological culturing. No LAB were detected from fermented mashes by PCR-DGGE using a universal bacterial PCR primer set. However, PCR-DGGE using a new primer specific for the 16S rDNA of Lactococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Enterococcus, and Vagococcus and two primers specific for the 16S rDNA of Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, and Weissella revealed that Enterococcus faecium, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Leuconostoc citreum, Leuconostoc mesenteroides, and Weissella cibaria inhabited in shochu mashes. It was also found that the LAB community composition during shochu fermentation changed after the main ingredient and water were added during the fermentation process. Therefore, we confirmed that PCR-DGGE using all three primers specific for groups of LAB together was well suited to the study of the LAB diversity in shochu mashes. The results of DGGE profiles were similar to the results of bacteriological culturing. In conclusion, LAB are present during shochu fermentation but not dominant.     

四川牦牛奶和曲拉中九株乳酸菌的分子鉴定

为准确鉴定分离自我国四川鲜牦牛奶和曲拉中9株乳酸菌到种水平,作者运用16S rDNA序列分析、recA基因特异扩增和hsp60-RFLP等多种分子技术对分离自我国四川地区鲜牦牛奶和曲拉中的9株乳酸菌进行分类鉴定。结果证实,16S rDNA序列分析法可将9株乳酸菌初步归类为植物乳杆菌群(4株),肠膜明串珠菌(4株),瑞士乳杆菌(1株)。由于16S rDNA序列分析法不能区分植物乳杆菌和戊糖乳杆菌,为了进一步鉴定植物乳杆菌群中的4株菌,继续采用recA基因特异扩增和hsp60-RFLP技术对其细分,结果表明recA基因特异扩增和hsp60-RFLP的方法均能很好地把植物乳杆菌群中的4株菌鉴定到种水平,且均为植物乳杆菌。     

Detection of Morganella morganii,a prolific histamine former,by the polymerase chain reaction assay with 16S rDNA-targeted primers

A polymerase chain reaction (PCR) assay for the rapid and sensitive detection of the most prolific histamine former, Morganella morganii, was developed. 16S rDNA targeted PCR primers were designed, and the primer specificity and sensitivity of the PCR assay were evaluated. The 16S rDNA sequence (1,503 bp) for M. morganii showed 95% identity to those for enteric bacteria, i.e., Enterobacter spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., Hafnia alvei, Proteus spp., and Providencia spp. The unique primers for M. morganii were designed on the basis of the variable regions in the 16S rDNA sequence. The primers showed positive reactions with all M. morganii strains tested. However, PCR amplification was not detected when the primers were tested with other enteric or marine bacteria. When the sensitivity of the assay was evaluated, M. morganii was detected at levels ranging from 10(6) to 10(8) CFU/ml in albacore homogenate after the PCR amplification. The sensitivity of the assay was greatly improved with the enrichment of samples, and 9 CFU of M. morganii per ml of albacore homogenate was detected after 6 h of enrichment at 37 degrees C.     

Rapid identification of Lactobacillus nantensis, Lactobacillus spicheri and Lactobacillus hammesii species using species-specific primers

Based on the 16S-23S ribosomal DNA (rDNA) intergenic spacer region (ISR), an identification tool for rapid differentiation of Lactobacillus nantensis, Lactobacillus spicheri and Lactobacillus hammesii, species isolated recently from French sourdough was developed. The DNA fragments containing ISRs were amplified with primers pairs 16S/p2 and 23S/p7. Clone libraries of the PCR-amplified rDNA with these primers were constructed using a pCR2.1 TA cloning kit and sequenced. The DNA sequences obtained were analyzed and species-specific primers were designed from these sequences. Two PCR amplicons, which were designated small ISR (S-ISR) and large ISR (L-ISR), were obtained for all Lactobacillus species studied. The L-ISR sequence reveale2d the presence of two tRNA genes, tRNAAla and tRNAIle. Species-specific primers designed allowed rapid identification of these species. The specificity of these primers was positively demonstrated as no response was obtained for more than 200 other species tested.     

食品中乳酸杆菌的实时荧光PCR的快速检测

本文运用实时荧光PCR(Real-time PCR)技术建立了对食品中常见的乳酸杆菌进行检测的快速方法.针对乳酸杆菌16S rDNA序列,设计了通用引物和特异性探针,进行TaqManTM实时PCR检测,以非同源性参考菌株做特异性检测;把乳酸杆菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.实验结果表明用实时荧光PCR法检测乳酸杆菌,快速、敏感、特异性高.     

应用RT-PCR技术定量检测发酵乳中Lactobacillus plantarum活菌数

根据发酵乳中常见乳酸菌种的16S rRNA基因序列设计了L.plantarum的种属特异性引物,应用该引物对植物乳杆菌的模式菌株L.plantarum ATCC14917、L.plantarum非同源性对照菌株及采自西藏地区的自然发酵乳样品进行了种属特异性PCR检测,并以样品RNA转录的cDNA为模板,对检出含有L.plantarum的发酵乳样品进行了Real-Time PCR定量检测。通过Real-Time PCR图谱分析,准确地检测出了该样品中L.plantarum活菌数的含量为6.6lgcfu/mL。结果表明该方法能够简便、快速地检测出发酵乳中是否含有L.plantarum,并能够对其活菌数进行准确地定量,对发酵乳的生产和监管提供了重要的理论和实践依据。     

食品中荧光假单胞菌聚合酶链式反应检测体系的建立和评价

建立用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测食品中荧光假单胞菌的方法。分别针对16～23S rRNA基因间隔区序列、gyrB基因以及通过生物信息学方法发掘到的4个种特异性基因设计6对检测引物,通过初步特异性实验,筛选出一对种特异性最佳的引物。最终建立以gyrB基因为检测靶点的PCR扩增体系,并对体系进行系统评价。结果表明:该方法可特异检测荧光假单胞菌的存在,纯DNA检测灵敏度为14.9fg/μL(2～3拷贝/μL),纯培养物检测灵敏度为2.8×102CFU/mL。豆奶样品经15h充分增菌可提高检测灵敏度至0.28CFU/25g。     

脆肉鲩鱼在冷藏条件下的特定腐败菌分析

利用16S rDNA克隆文库及限制性内切酶片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)技术分析脆肉鲩鱼在冷藏条件下的特定腐败菌。分别提取新鲜鱼肉及腐败的脆肉鲩鱼肉样品中的细菌总DNA并利用通用引物27F/1492R进行PCR扩增,所得PCR产物用于构建克隆文库,阳性克隆子用RFLP进行分析。结果表明:新鲜鱼肉的克隆文库中细菌种类比较丰富,达15种类型,而腐败鱼肉的细菌种类只有7种,且有2种分型的细菌占优势,共占克隆子总数的88.4%。序列比对分析表明,这2种优势菌的16S rDNA序列与假单孢菌属(Pseudomonas)细菌的核苷酸序列的相似性高达99%,说明脆肉鲩鱼在冷藏条件下的特定腐败菌是假单孢菌(Pseudomonassp.)。