酿酒酵母钙通道膜蛋白单克隆抗体制备及鉴定

以酿酒酵母电压门控钙通道膜蛋白（Cch1p）、牵张敏感性钙通道膜蛋白（Mid1p）和瞬时受体电位钙通道膜蛋白（Yvc1p）为研究材料，制备其单克隆抗体。采用生物信息学方法确定3种膜蛋白抗原表位，根据分析结果克隆抗原基因，并进行原核表达和表达产物分析鉴定，通过Ni²⁺-NTA树脂亲和层析技术获得重组抗原蛋白，免疫小鼠后细胞融合技术制备单克隆抗体，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测抗体效价，免疫印迹技术检测单克隆抗体对重组纯化抗原和天然酿酒酵母钙通道膜蛋白的反应性和特异性。生物信息学分析结果表明，Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原表位可能分别位于1~300位氨基酸残基、359~548位氨基酸残基、1~236位氨基酸残基；克隆目的基因条带大小分别为926bp、570bp和708bp，与预期结果一致；原核表达抗原蛋白分子量分别为60000、25000和30000，Western blot检测条带正确；重组纯化抗原免疫BALB/c小鼠，细胞融合技术制备单克隆抗体，ELISA检测显示单克隆抗体效价分别高达1∶256000、1∶128000和1∶64000，Western blot检测到3种重组纯化抗原和天然酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p。这些结果说明本文制备的单克隆抗体可以成功用于检测酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p表达的相关研究。     

幽门螺杆菌全菌抗原对母鸡的免疫原性

目的　研究幽门螺杆菌 (Hp)全菌抗原的免疫原性及Anti Hp IgY的预防和治疗作用。方法　用超声Hp波粉碎的Hp抗原免疫产蛋母鸡 ,通过IHA和ELISA间接法检测母鸡的免疫应答。用SDS PAGE分析Hp全菌抗原 ,并用抗Hp IgY做免疫印迹。结果　母鸡免疫成功率为 10 0 %。初免 45d后 ,抗Hp IgYIHA效价为 1∶10 2 4,ELISA效价超过 1∶45 0 0 0。Hp抗原的SDS PAGE显示有 2 6条蛋白染色带 ,其中主带有 10条 ,免疫印迹表明Hp的超声粉碎物特异性抗原蛋白带相对分子质量为 70 0 0 0、6 6 0 0 0、42 0 0 0、3430 0、2 95 0 0、2 70 0、185 0 0。结论　本研究为工业化制备抗Hp IgY奠定了基础     

铜绿假单胞菌RhlR抗血清制备

目的在原核系统中表达铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1的调控蛋白RhlR,制备兔抗RhlR抗血清。方法构建重组表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR并转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达GST-RhlR和His-RhlR蛋白,经GST或Ni~(2+)亲和层析纯化重组蛋白。将His-RhlR蛋白免疫新西兰大白兔,制备RhlR抗血清,GST-RhlR蛋白包被ELISA板,检测效价。结果构建的表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR经双酶切及测序鉴定证明构建正确;构建的工程菌表达的目的蛋白His-RhlR和GST-RhlR相对分子质量分别为29 000和54 000,表达量均约占菌体总蛋白的85%,纯度大于90%。制备的RhlR抗血清效价可达1∶80 000。结论获得高效价的RhlR抗血清,为PA中rhl调控系统的研究奠定基础。     

羊布鲁菌膜蛋白的提取及血清抗体间接ELISA检测方法的建立

目的提取羊布鲁菌标准强毒株16m膜蛋白,分析其反应原性,并建立血清抗体间接ELISA检测方法。方法利用碳酸盐方法提取羊布鲁菌标准强毒株16m膜蛋白,12%SDS-PAGE分析其相对分子质量范围;用自然感染羊布鲁菌的阳性血清进行Westernblot分析,初步确定膜蛋白组分中能够发生免疫反应的条带;用方阵滴定法确定抗原和抗体的最佳稀释度,建立间接ELISA检测方法,并进行特异性和精密性验证;检测免疫豚鼠的血清抗体效价;对临床上采集的羊血清样品进行检测,并与虎红平板凝集试验结果进行比较。结果分离的羊布鲁菌膜蛋白浓度为9.4μg/μl;SDS-PAGE分析显示,羊布鲁菌膜蛋白的相对分子质量主要集中在17000～80000之间;Westernblot分析显示多条特异性反应条带。膜蛋白抗原的最佳稀释度为1∶1280,抗体最佳稀释度为1∶10。所建立的ELISA方法特异性和精密性良好。ELISA检测豚鼠血清效价为1∶64000。检测临床510份羊血清样品,阳性率为86.3%,高于虎红平板凝集试验检出的阳性率(41.2%)。结论已成功提取了羊布鲁菌膜蛋白,其具有良好的反应原性,并建立了血清抗体间接ELISA检测方法。     

酿酒酵母残留蛋白ELISA定量检测方法的建立

目的建立酿酒酵母残留蛋白(Host cell protein,HCP)ELISA定量检测方法,为重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)及相关生物制品的质量控制提供依据。方法制备酿酒酵母全细胞蛋白参考品,以其为抗原,免疫家兔,采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,SDS-PAGE分析纯度,免疫双向扩散法测定抗体效价,Western blot法分析抗体的特异性。以制备的抗酿酒酵母多克隆抗体作为包被抗体,HRP标记的抗酿酒酵母多克隆抗体作为检测抗体,建立酿酒酵母抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法;梯度稀释酿酒酵母蛋白抗原参考品,并绘制标准曲线,确定该方法的线性范围及检测限,并进行特异性、准确度、精密度及适用性验证。结果共制备3批酿酒酵母抗原蛋白,其平均含量分别为1.61、1.64和1.63 mg/ml;纯化的IgG抗体纯度为91.7%,抗体效价为1∶64,能与酿酒酵母蛋白多数条带结合;酿酒酵母蛋白抗原浓度在6.25～200 ng/ml的范围内,线性关系良好(R2>0.99),最低检测限为6.25 ng/ml;用建立的方法检测小牛血清、人血白蛋白、MEM培养基、Vero细胞上清蛋白、Vero细胞乙型脑炎疫苗及PHK细胞狂犬疫苗,均无交叉反应,特异性良好;检测不同浓度的抗原回收率为97.6%～107.00%,变异系数均<10%,最低定量检测限为25 ng/ml;检测3批酿酒酵母重组乙型肝炎疫苗生产各工序中酿酒酵母蛋白的残留量,能有效反映杂蛋白去除率。结论成功建立了酿酒酵母HCP双抗体夹心ELISA定量检测方法,该方法特异性强,精密度及准确度良好,可用于生物制品中酿酒酵母HCP的检测。     

MUC1核心肽多克隆抗体的制备及鉴定

目的　制备MUC1核心肽多克隆抗体 ,用于靶向MUC1肿瘤治疗的研究。方法　以 8R -MUC1核心肽 6重复序列重组蛋白 (8R MUCPT)为抗原免疫家兔 ,以ELISA法确定抗MUC1多克隆抗体效价 ,以Westernblot和ELISA阻断试验鉴定抗体特异性。结果　MUC1核心肽多克隆抗体效价为 1∶2 5 6 0 0 0 ,能与MUC1核心肽特异性结合。结论　利用原核表达的 8R -MUCPT蛋白 ,可有效地诱导免疫动物产生MUC1核心肽特异性抗体 ,为MUC1核心肽靶向肿瘤特异性免疫研究提供了有力的实验材料。     

戊型肝炎病毒重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒的制备

目的制备戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒。方法以4型HEV ORF2重组蛋白P179免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法进行克隆化培养,制备腹水,并对杂交瘤细胞进行染色体计数,鉴定单抗亚类及特异性、并检测稳定性;经SDS-PAGE分析抗体纯度,以兔抗179抗原多抗作为包被抗体,HRP标记P179单抗作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,制备试剂盒,并进行最佳线性范围测定、准确性、精密性和稳定性验证。结果获得4株能稳定分泌抗P179抗原单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3A10、3F8、4E9和5G6,腹水抗体效价分别为1∶10-7、1∶10-6、1∶10-6和1∶10-7,染色体数分别为96、98、101和99条;亚类分别为IgG2a、IgG2a、IgG1和IgG2b;4株单抗连续传代3个月,液氮冻存1年抗体效价未发生变化;制备的试剂盒有良好的线性(R2>0.950 0)、准确性、精密性,试验内变异系数为4.17%～6.26%,回收率在87.9%～114.8%之间,试验间变异系数为5.82%～8.01%,回收率在90.8%～108.9%之间;于37℃及4℃放置3 d,仍具有良好的稳定性。结论成功制备了戊型肝炎病毒P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒,可用于戊型肝炎疫苗生产中定量检测疫苗抗原。     

癌-睾丸抗原OY-TES-1多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备癌-睾丸抗原OY-TES-1多克隆抗体,并进行鉴定。方法以大肠杆菌表达的MBP/OY-TES-1融合蛋白作为抗原,免疫新西兰白兔,制备抗血清。经蛋白A凝胶纯化后,采用ELISA法检测抗血清的效价,Western blot和免疫组化法检测多克隆抗体的特异性。结果制备的抗血清经ELISA检测,效价不低于1∶128000,纯化后,其效价不低于1∶8000。Western blot显示,抗OY-TES-1多抗可与MBP/OY-TES-1融合蛋白、MBP、OY-TES-1重组蛋白和睾丸组织总蛋白特异性结合;免疫组化检测显示,精子头部呈现阳性反应。结论已成功制备了效价高、特异性强的癌-睾丸抗原OY-TES-1多克隆抗体,为深入研究OY-TES-1的生物学功能提供了工具。     

铜绿假单胞菌3型O-特异性多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫特性分析

目的研制铜绿假单胞菌3型O-特异性多糖(O-specific polysaccharide,O-SP)-破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)结合疫苗,并分析其免疫特性。方法采用热酚水法提取铜绿假单胞菌国际抗原分型系统(International Antigen Typing System,IATS)3型菌株的脂多糖(Lipopolysacchride,LPS),去除类脂A后纯化O-SP,用1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化O-SP,己二酸二肼(ADH)作为连接臂,在碳二亚胺(EDAC)作用下,与TT结合制备O-SP-TT结合疫苗,检测其理化性质,并分析结合疫苗的免疫原性和免疫保护性。结果 O-SP收获量相当于水解LPS量的30%,其蛋白质和核酸含量均低于1.0%,O-SP衍化度为3.83%,O-SP与TT的结合率约为40%,多糖蛋白质比(w/w)为1∶2.18。O-SP-TT结合疫苗可刺激小鼠产生高效价的IgG抗体,与O-SP组相比,差异有统计学意义(P0.05);结合疫苗免疫小鼠能保护5 LD50和10 LD50活菌的攻击,小鼠免疫O-SP-TT后兔抗血清对3 LD50和5 LD50活菌攻击具有良好的保护作用。结论制备的铜绿假单胞菌3型O-SP-TT结合疫苗具有良好的免疫原性和免疫保护性,该疫苗有望成为防治IATS 3型铜绿假单胞菌感染的有效疫苗。     

恶性疟原虫环子孢子蛋白四肽重复序列单克隆抗体的制备

目的制备针对恶性疟原虫环子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)NANP四肽重复序列[Asn-Ala-AsnPro(NANP)repeated motif]的单克隆抗体。方法采用马来酰亚胺修饰的BSA与(NANP)5C偶联法及ADH-EDC介导的BSA与(NANP)5偶联法,将合成的NANP多肽与载体蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠后,采用免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0杂交的细胞融合技术,获得分泌抗(NANP)5多肽单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,间接ELISA法检测效价。通过免疫F1小鼠诱生腹水,采用50%硫酸铵沉淀法盐析纯化后,进行单克隆抗体亚类和特异性鉴定。结果采用2种方法制备了BSA-(NANP)5偶联蛋白,以该蛋白为抗原,获得10株抗(NANP)5多肽阳性杂交瘤细胞株,效价在1∶80 000~1∶640 000之间,均为Ig G1亚类,轻链类型为κ,可被(NANP)5及CSP抗原特异性识别。结论成功制备了抗(NANP)5多肽的单克隆抗体,该抗体可在恶性疟疾疫苗的研发中发挥重要作用。     

疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法的建立

目的建立疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法。方法制备Vero细胞蛋白抗原参考品,免疫家兔,提纯抗体作为包被抗体并以酶标记,建立酶联免疫检测系统。用Vero细胞蛋白抗原参考品绘制定量标准曲线,并对各项指标进行验证。结果提纯后抗体纯度达90%以上,抗体效价为1∶64,Westernblot分析显示,提纯抗体与Vero细胞蛋白抗原参考品中绝大部分蛋白成分均能特异性结合。确定最佳抗体包被浓度为10μg/ml,酶标抗体的工作浓度为1∶1000。Vero细胞蛋白抗原参考品定量范围为12.5～800.0ng/ml时,线性关系良好,r=0.997,该方法特异性、精密度及准确度良好。将试剂于4、25和37℃分别放置3周,检测同一定量参考品和样品中Vero细胞蛋白抗原含量,差异无显著意义。结论已建立了用ELISA检测疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量的方法。     

结核分枝杆菌Rv0674蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的在大肠埃希菌(E. coli)中表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)Rv0674蛋白,纯化后制备多克隆抗体,并检测抗体效价。方法用PCR技术从MTB H37Rv基因组中扩增Rv0674基因,克隆至p EASYBlunt E1表达载体后,转化入E. coli BL21(DE3)中,用优化后的IPTG诱导表达条件表达Rv0674蛋白,His trap TM HP亲和层析柱纯化目的蛋白;将纯化的蛋白腹腔注射BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA和Western blot法检测抗体效价及特异性。结果成功获得了Rv0674序列正确的重组质粒p EASY-E1-Rv0674,挑选出了高表达Rv0674基因的菌株,确定的最适表达条件为1. 0 mmol/L IPTG 28℃诱导表达8 h,获得了相对分子质量约26 500的可溶性蛋白;免疫BALB/c小鼠后,能刺激小鼠产生多克隆抗体,获得的抗血清具有良好的抗原结合特性,且效价大于1∶51 200。结论成功获得了高纯度的Rv0674蛋白,并首次制备出小鼠抗Rv0674蛋白的多克隆抗体,为进一步研究Rv0674蛋白的功能和临床诊断结核病(tuberculosis,TB)的应用奠定了基础。     

MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体的制备、纯化及初步应用

目的 制备MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体,并进行纯化及初步应用,为进一步研制宿主细胞残留蛋白检测试剂盒奠定基础.方法 无血清悬浮培养MDCK细胞,采用不同方法(反复冻融、裂解液、超声)裂解细胞获得全细胞蛋白抗原.将抗原与弗氏佐剂乳化后经背部多点皮下免疫家兔,间接ELISA法检测血清抗体效价,当抗体效价≥1 × 10...     

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的原核表达美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(North American genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus,NA-PRRSV)N蛋白,并制备多克隆抗体。方法以NA-PRRSV QH-08毒株的RNA为模板,扩增N蛋白编码片段,克隆入原核表达载体p ET30a(+),构建重组表达质粒pET30a-NA-PRRSV-N,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6 h。采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化表达的重组蛋白,复性后的重组N蛋白与弗氏佐剂混合乳化,经背部多点免疫新西兰大耳白兔,制备兔抗NA-PRRSV-N蛋白多克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验检测多克隆抗体的特异性,间接ELISA法检测血清抗体效价。结果经PCR、双酶切和测序鉴定,重组表达质粒p ET30a-NA-PRRSV-N构建正确;重组N蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为24 000,纯度可达95%以上,可与NA-PRRSV阳性猪血清发生特异性反应;制备的多克隆抗体能够识别重组N蛋白和全病毒抗原,抗体效价1∶25 600,显著高于商品化疫苗组。结论成功在大肠埃希菌中表达了NA-PRRSV N蛋白,并制备了其多克隆抗体,为NA-PRRSV检测方法的建立奠定了基础。     

两种免疫途径制备的肠道病毒71型兔血清抗体效价比较

目的比较两种免疫途径制备的肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)兔血清抗体效价。方法将EV71灭活疫苗原液分别经皮下及肌内注射途径免疫两组家兔,每组5只,剂量均为5μg/只,两组均分别于0、7、14及28 d各免疫1次,初次免疫抗原与等量弗氏完全佐剂充分混合,后续免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂充分混合。两组均于初次免疫前及每次免疫后7 d经家兔耳缘动脉采血,分离血清,检测血清中和抗体效价。结果两种免疫注射途径均可诱导家兔产生较高的抗体效价,7只家兔血清抗体效价均 1∶10 000,皮下注射组有3只,肌内注射组有4只;肌内注射组血清抗体效价整体优于皮下注射组,在初次免疫后第21天时尤其明显(P 0. 05)。结论肌内注射途径制备的兔血清抗体效价高于皮下注射,本实验为今后制备高效价血清抗体提供了参考。     

14-3-3 zeta蛋白C-端多肽抗体的制备与鉴定

目的制备14-3-3 zeta蛋白C-端多肽多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法用生物信息学分析14-3-3 zeta蛋白的同源性、亲水性和抗原性,设计并合成zeta蛋白C-端特异性的氨基酸序列,将其与牛血清白蛋白铰链;分别转化14-3-3的7个亚型质粒于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,并分离纯化His-zeta融合蛋白;分别以zeta C-端多肽及zeta融合蛋白为抗原,免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体;用Western blot分析zeta蛋白C-端多肽抗体亚型特异性,并用该特异性抗体检测zeta蛋白在COS-7细胞中的分布规律。结果在14-3-3的7个亚型蛋白存在的条件下,zeta蛋白C-端多肽抗体仅识别zeta亚型蛋白,而zeta融合蛋白抗体可以识别gamma、zeta、tau3种亚型;14-3-3zeta蛋白主要分布在COS-7细胞质一侧。结论已获得了亚型特异性的14-3-3zeta多克隆抗体,该抗体可用于14-3-3zeta免疫细胞化学等分析。     

人与猪、牛、羊血清的抗原比分析

生物制品的制备均离不开动物作为生产的媒体,选择与人抗原性较为接近的动物是制备生物制品,特别是治疗用生物制品优先考虑的因素。为此,对常用的大中型实验动物与人的抗原性进行了比较分析。人血清采自大连市血站健康献血人员,猪、牛、羊血清均采自屠宰场。将上述血清分别免疫健康鸡,抗体效价(免疫双扩法)>1∶8时采血,分离血清,以抗人血清抗体分别对人、猪、牛、羊抗原(血清)测定效价。同时分别用抗猪、牛、羊抗体对人抗原(血清)测定效价。均采用免疫双向琼脂扩散法。阴性反应效价按1∶0.5计。抗原比计算:r=r1·r2r1=Ag1对Ab2效价/Ag1对Ab…     

利用HCV多表位复合抗原制备高效价抗体

目的利用HCV多表位复合抗原免疫家兔制备高效价抗HCV多克隆抗体,为改进丙型肝炎病毒抗原的诊断试剂盒提供必要条件。方法HCV多表位复合抗原与完全弗氏佐剂混合免疫家兔,获得高效价抗血清,经硫酸铵沉淀及PrintA/G亲和层析纯化。结果已获得效价大于1∶16000的抗HCV多克隆抗血清,经纯化后达电泳纯。该抗体能与HCVNS3、NS5及C抗原特异性结合。结论HCV多表位复合抗原具有较好的免疫原性,可用于改进HCV病毒抗原诊断试剂。     

聚合酶链式反应技术检测化妆品中的铜绿假单胞菌

利用聚合酶链式反应(PCR)技术建立了一种快速检测化妆品中铜绿假单胞菌的方法。根据已报道的铜绿假单胞菌特异性基因ETA设计引物,确定引物的特异性和灵敏度;对染菌化妆品样品进行增菌检测。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果显示,仅在含有铜绿假单胞菌基因组的样品中得到条带;对染菌样品的扩增结果显示,可以在原样品的活菌浓度为6 cfu.mL-1时通过增菌12 h后检出。     

人博卡病毒1型主要抗原NS1、NP1及VP1/2的抗体制备及应用

人博卡病毒1型(human bocavirus 1,HBoV1)是全球流行的重要呼吸道病毒,其研究尚处于初期阶段。通过原核表达的方式对HBoV1主要抗原NS1、NP1、VP1/2进行蛋白表达,通过纯化、免疫小鼠成功获得3种蛋白的抗体血清,通过ELISA评价了抗体对相应蛋白抗原及临床HBoV1阳性样品的效价,并将所制备的抗体成功用于HBoV1广州株GU338055反向遗传系统的NS1、NP1、VP1/2的免疫荧光研究。结果表明,所制备抗体在1∶50稀释度时A_(450)值对阴性对照约有4倍提升,为HBoV1后续深入研究提供了重要工具,具有重要意义。