凋亡抑制因子Survivin在小鼠内耳发育中的作用

目的探讨凋亡抑制因子Survivin在小鼠内耳发育中的作用。方法应用HE染色观察小鼠内耳发育形态演变过程、免疫组织化学方法检测Survivin在小鼠12~17d胚胎、生后14d内乳鼠内耳的表达情况。结果Survivin在听泡上皮增殖期表达最广泛,在分化成熟期表达逐渐增强,而范围减小。结论Survivin参与小鼠内耳发育,在细胞增殖与分化、器官塑形过程中起一定的作用,为探索毛细胞再生和耳聋防治奠定基础。     

Survivin在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨凋亡抑制因子Survivin在结直肠癌组织中的表达及其与各临床病理因素之间的相关性。方法应用RT-PCR技术检测58份结直肠癌组织及其癌旁正常组织标本中Survivin基因的表达,回顾性分析其与诸多临床病理因素间的相关性。结果在58份结直肠癌组织中,Survivin基因的阳性表达率为84.5%,而在癌旁正常组织中均不表达,二者差异有统计学意义。在癌组织中,Survivin的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位及组织分化程度无明显相关性,但与Dukes分期及有无淋巴结转移密切相关。结论Survivin基因在结直肠癌组织中高表达,并与病理分期、有无淋巴结转移等恶性临床病理特征有密切相关性,提示Survivin在结直肠癌的发生、发展及预后中发挥重要作用。     

细胞因子信号抑制因子1基因真核高表达质粒的构建及其在NOK细胞中的表达

目的构建细胞因子信号抑制因子1(suppressors of cytokine signaling 1,SOCS1)基因真核高表达质粒,并在口腔上皮细胞系NOK细胞中进行表达。方法提取健康人外周静脉血基因组DNA,PCR扩增SOCS1基因,与p EGFPN1载体连接,构建重组真核表达质粒p EGFP-N1-SOCS1,用Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切鉴定及测序后,转染NOK细胞,采用荧光显微镜及Western blot法检测转染细胞中SOCS1蛋白的表达。结果重组真核表达质粒p EGFP-N1-SOCS1经双酶切及测序鉴定证实构建正确。p EGFP-N1-SOCS1转染NOK细胞72 h后获得表达,SOCS1蛋白的表达量为(134.67±9.07)%,较转染空质粒组约升高4倍,二者差异有统计学意义(P=0.001)。结论成功构建了SOCS1基因真核高表达质粒,为进一步研究SOCS1的生物学功能奠定了基础。     

人破骨细胞形成抑制因子活性域片段在大肠杆菌中的融合表达

目的　在大肠杆菌中高效融合表达人破骨细胞形成抑制因子 (Osteoclastogenesisinhibitoryfactor,OCIF)活性域片段。方法　从中国人正常肝细胞系LO2中提取总RNA ,利用RT PCR得到OCIF活性域编码基因cDNA ,将其与pMD18 T连接 ,转化大肠杆菌K80 2 ,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18 OCIFAD ,经双酶切得到OCIF活性域编码片段 ,将其插入pMAL c2载体中 ,转化大肠杆菌TB1。筛选得到阳性重组表达子后进行诱导表达。结果　所获得的OCIF活性结构域编码序列片段经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDS PAGE分析可见在相对分子质量 6 0 0 0 0处出现一条特殊条带 ,与预期的相对分子质量一致。Westernblot证实了表达产物能与抗人OCIF单抗发生特异性反应。结论　已成功地获得了人OCIF活性结构域编码片段的克隆 ,并实现了其在大肠杆菌中的融合表达。表达产物对体外培养破骨细胞的骨吸收功能有明显的抑制作用。     

重组人核糖核酸酶抑制因子腺相关病毒的构建及表达

目的构建携带全长人核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease inhibitor,RI)基因的重组腺相关病毒,并在膀胱癌细胞T24中表达。方法 Trizol法提取人脐静脉内皮细胞ECV30总RNA,经RT-PCR扩增RI基因,克隆至pUCm-T质粒中,再亚克隆至pAAV-IRES-hrGFP载体,构建pAAV-IRES-hrGFP-RI重组质粒,与pAAV-RC和pAAV-Helper质粒共转染HEK293细胞,包装并扩增腺相关病毒RI-AAV,检测其感染性滴度,并转染T24细胞,采用RT-PCR检测RI基因mRNA的转录水平,Westernblot检测RI蛋白的表达水平。结果重组质粒pAAV-IRES-hrGFP-RI经酶切及测序鉴定构建正确;重组腺相关病毒RI-AAV的感染性滴度为1.1×1010U/ml;RI-AAV转染的T24细胞RI基因mRNA的转录水平及蛋白表达水平较未转染组及空病毒转染组均显著提高,且差异均有统计学意义(P<0.05)。结论已成功构建人RI基因重组腺相关病毒,为进一步研究RI对膀胱癌细胞的侵袭和转移的作用奠定了基础。     

PI3K/AKT信号在增强乳腺癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体敏感性中的作用及其机制

目的分析磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路是否通过长细胞caspase-8样抑制蛋白(cellular FLICE inhibitory protein,c-FLIP-L)的介导来影响乳腺癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)的敏感性,并探讨其机制。方法用40 nmol/L wortmannin(AKT活化的特异性抑制剂)、100 ng/ml TRAIL、40 nmol/L wortmannin+100 ng/ml TRAIL处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞,并设空白对照组。MTT法检测药物作用24、48、72 h后的细胞增殖抑制率;流式细胞术检测药物作用48 h后的细胞凋亡率;Western blot法检测细胞中磷酸化AKT(pAKT)和c-FLIP-L的表达。结果TRAIL+wortmannin组24、48和72 h细胞增殖抑制率与其他组比较,均明显升高(P0.05);TRAIL+wortmannin组与TRAIL组和wortmannin组比较,可明显促进细胞凋亡(P0.05);随着wortmannin作用时间的延长,pAKT的表达水平明显降低,同时c-FLIP-L的表达水平也随之下降,而TRAIL对pAKT和c-FLIP-L的表达无明显影响。结论抑制PI3K/AKT通路可增强乳腺癌细胞对TRAIL的敏感性,这种作用可能是通过c-FLIP-L的介导来实现的。     

破骨细胞抑制因子生物活性定量测定方法的建立

目的以破骨细胞为模型,建立抑制破骨细胞功能药物的生物活性定量测定方法。方法将小鼠RAW264.7和SP2/0细胞在含地塞米松和1,25(OH)2VitD3的破骨细胞诱导分化液中混合培养,通过TRAP染色鉴定破骨细胞的成熟。加入不同浓度的rhOPG-Fc,检测其对RAW264.7细胞增殖、分化和成熟破骨细胞活性的抑制作用,计算药物的IC50,并定量计算活性单位。结果rhOPG-Fc对RAW264.7细胞增殖抑制的IC50为0.02mg/L,其生物活性为50U/mg;对RAW264.7细胞分化抑制的IC50为0.02mg/L,其生物活性为50U/mg;对成熟破骨细胞活性抑制的IC50为0.18mg/L,其生物活性为5.5U/mg。结论以破骨细胞抑制因子为候选药物所建立的细胞学模型,可方便快速地定量测定破骨细胞抑制类药物的生物活性,且能协助判断药物的作用机理。     

姜黄素对人喉癌Hep-2细胞的生长抑制及诱导凋亡作用

目的探讨姜黄素(Curcumin)对人喉癌Hep-2细胞的生长抑制及诱导凋亡作用。方法将Hep-2细胞用含不同浓度姜黄素(3、6、12.5、25μmol/L)的培养基分别培养24和48h,采用MTT法检测其对细胞增殖的影响;台盼蓝染色法检测其对细胞活力的影响;流式细胞术检测其对细胞周期分布及细胞凋亡的影响;DNA琼脂糖凝胶电泳检测其对细胞DNA的影响。结果姜黄素可明显抑制Hep-2细胞增殖,且呈时间-剂量依赖性;可明显降低细胞活力,且呈剂量依赖性;可使细胞阻滞在G2/M期,并诱导细胞出现典型的凋亡峰,凋亡率呈时间-剂量依赖性;能使细胞DNA形成典型的DNA-Ladder。结论姜黄素对人喉癌Hep-2细胞增殖及细胞活力具有显著的抑制作用,并能诱导Hep-2细胞发生凋亡。     

可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在E.coil中的表达、纯化及其生物学活性

目的表达纯化可溶性肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosisinducing ligand,TRAIL)蛋白,并测定其生物学活性。方法利用E.coli中表达C-端带有6×His标签的可溶性TRAIL蛋白,并优化诱导时间(4、6和8 h)和诱导剂IPTG的浓度(0.06、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L)。表达产物经Ni亲和层析和离子交换层析纯化后,采用MTT法测定不同浓度TRAIL(终浓度分别为100、200、400 ng/ml)的活性,并检测亲和层析过程中两种洗脱方式(洗脱液4℃留柱过夜后进行洗脱和洗脱液进柱后直接收集流出液)及纯化过程中两次透析的时间(均为24和48 h)对TRAIL活性的影响。结果最佳诱导时间为6 h,最佳IPTG诱导浓度为0.5 mmol/L。表达产物的表达量占菌体总蛋白的20%,相对分子质量为20 000,可与兔抗人TRAIL单克隆抗体发生特异性结合。TRAIL终浓度为100、200和400 ng/ml的实验组的抑制率分别约为36%、53%和73%。亲和层析的两种洗脱方式的TRAIL活性差异无统计学意义(P0.05),透析48 h比透析24 h获得的TRAIL活性显著降低(P0.05)。结论 TRAIL蛋白成功在E.coli中表达,具有抑制肿瘤细胞生长的作用,优化后的TRAIL诱导条件和纯化方法可进一步大量生产高TRAIL蛋白的活性,满足了TRAIL的基础及临床相关研究的要求。     

VEGF在小儿囊状淋巴管瘤的表达及其临床意义

目的探讨小儿囊状淋巴管瘤的发病机制,明确小儿颈部囊状淋巴管瘤的病理性质,为临床治疗方案提供一定的指导。方法免疫组化法(S-P法)检测血管内皮生长因子(VEGF)在48例小儿囊状淋巴管瘤组织中的阳性表达情况,并以20例大月份引产胎儿的胸导管作为正常淋巴管组织对照。结果VEGF在小儿囊状淋巴管瘤中阳性表达率为21%与正常淋巴管组织阳性表达无明显差异(各组P值均>0.05)。结论小儿囊状淋巴结瘤可能是一种淋巴管畸形而非真性肿瘤。     

喉癌组织中P53与微血管密度相关性

目的　探讨P5 3蛋白在喉癌中的表达及其与血管生成和转移的相关性。方法　通过免疫组化SP法检测 4 2份喉癌患者标本中P5 3蛋白表达及微血管密度 (microve -ssedensity ,MVD)。结果　喉癌组织中P5 3蛋白阳性表达率为 4 7 6 2 % ,MVD平均为 35 .79,标准差为 9.4 9。淋巴结转移的肿瘤中P5 3阳性表达及MVD明显高于非转移组 ,P5 3蛋白阳性表达标本中MVD值较高的现象多于有颈淋巴结转移的喉癌。结论　突变型P5 3基因的表达对喉癌肿瘤微血管生成及肿瘤颈淋巴结转移可能具有协同作用。     

双氢青蒿素对前列腺癌PC-3细胞生长及Survivin表达的影响

目的观察双氢青蒿素(DHA)对前列腺癌PC-3细胞生长及Survivin表达的影响,并探讨其作用机制。方法PC-3细胞经不同浓度的DHA处理后,MTT法检测细胞增殖抑制率;将PC-3细胞注入裸鼠右侧腋窝下,建立裸鼠种植瘤模型,将20只模型鼠随机分为空白对照组、DMSO对照组、DHA高剂量组(200μmol/kg体重)和低剂量组(100μmol/kg体重),经13d干预后,计算抑瘤率;光镜及电镜观察肿瘤组织形态学改变,免疫组织化学法检测Survivin的表达,TUNEL法检测细胞凋亡。结果DHA可显著抑制PC-3细胞的增殖,并具有时间、浓度依赖性;DHA对裸鼠种植瘤生长具有明显的抑制作用,抑瘤率达60%以上;光镜及电镜观察到DHA两剂量组肿瘤组织中散在凋亡细胞及凋亡小体;DHA两剂量组细胞Survivin表达减弱,凋亡率明显升高。结论DHA可明显抑制PC-3细胞生长,其机制与下调Survivin的表达并诱导肿瘤细胞凋亡有关。     

Survivin启动子调控的EGFP基因真核表达质粒的构建及其在肺癌细胞中的特异性表达

目的构建由Survivin启动子调控的EGFP基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达。方法以A549细胞基因组DNA为模板,PCR扩增Survivin启动子,替换pEGFP-C1载体中的CMV启动子,构建携带Survivin启动子的pEGFP-C1真核表达质粒pEGFP-C1/Surp,转染A549细胞及人胚肺成纤维细胞MRC-5,在荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果重组表达质粒pEGFP-C1/Surp经双酶切和测序鉴定,证明构建正确。转染A549细胞和MRC-5细胞后,在荧光显微镜下可见A549细胞有较强的绿色荧光,而MRC-5细胞则未见绿色荧光。结论已成功构建以Survivin启动子为调控序列、EGFP为标示蛋白的真核表达质粒,且具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤靶向性基因治疗载体奠定了基础。     

结直肠癌E-Cadherin的异常表达及其临床意义

目的探讨结直肠癌组织中E-Cadherin的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学S-P法检测60例结直肠癌及癌旁正常组织E-Cadherin的表达,并分析其与结直肠癌临床病理特征的关系。结果结直肠癌组织中E-Cadherin阳性表达率为71.67%。E-Cadherin的表达与结直肠癌Dukes分期、浆膜浸润、淋巴结转移、肝转移均呈正相关(P<0.05)。结论E-Cadherin表达与结直肠癌浸润转移密切相关。检测E-Cadherin表达可作为判断结直肠癌预后的客观指标。     

人参皂苷Rh2诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的研究

目的研究人参皂苷Rh2(G-Rh2)对人胃癌细胞SGC-7901的影响。方法采用MTT法检测G-Rh2对SGC-7901细胞存活率的影响;流式细胞分析法检测凋亡小体的含量;免疫印迹技术及体外Caspase-3/-7活力测定方法检测Caspase的激活状态。结果G-Rh2对SGC-7901细胞生长有明显的抑制作用,且呈量-效关系,IC50为9.3μg/ml。7.5μg/mlG-Rh2作用SGC-7901细胞24h,凋亡细胞数量为6.97%。7.5μg/mlG-Rh2作用SGC-7901细胞20h,出现多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]断裂,Caspase-3/-7活力开始出现,并随作用时间的延长而增强。结论G-Rh2诱导Caspase参与SGC-7901细胞凋亡。     

RhoC基因沉默对肝癌细胞Bel7402凋亡和迁移的影响

目的研究RhoC基因沉默对肝癌细胞Bel7402凋亡和迁移的影响。方法以RNAi沉默Bel7402细胞RhoC基因的表达,FACS和RT-PCR检测细胞凋亡和凋亡相关基因水平,细胞划痕损伤和软琼脂克隆形成试验检测细胞迁移和生长特性。结果RNAi组细胞凋亡率明显高于细胞对照组,RNAi组Bcl-2表达水平明显低于细胞对照组,只有RNAi组可检测到Bax基因的表达。两对照组细胞划痕损伤在48h内愈合,而RNAi组则不能修复。RNAi组软琼脂克隆形成能力明显低于两对照组。结论RhoC基因沉默能够促进肝癌细胞Bel7402凋亡并抑制细胞迁移和非锚定生长能力。     

刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体在大肠杆菌中表达及在tPA纯化中的应用

目的构建刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体(rserETI)原核表达载体,制备表达产物,用于tPA的纯化。方法设计合成rserETI编码序列DNA片段,以PCR法扩增出全长编码区序列,经酶切后克隆至pET9a表达载体,转化大肠杆菌JM109DE3,以IPTG诱导表达。表达产物经变性、复性、QFF层析纯化后,测定其活性,并与溴化氰活化的Sepharose偶联合成亲和层析柱,纯化rtPA。结果rserETI的表达量约占大肠杆菌菌体总蛋白的30%,复性率为80%,经QFF层析纯化后,蛋白浓度为1.58mg/ml,SDS-PAGE检测显示无杂蛋白污染,纯度大于95%,对rtPA突变体的抑制比活性为4×104IU/mg。偶联合成的rserETI-Sepharose亲和层析柱能特异性地纯化rtPA,rtPA突变体纯度达96%,比活性为5.07×105IU/mg。结论已成功构建了rserETI原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达,制备的表达产物可用于rtPA的纯化。