蜂毒明肽的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化蜂毒明肽。方法人工合成蜂毒明肽基因,与肠激酶识别序列基因串联,插入原核表达载体pGEX-2T中,构建蜂毒明肽与谷胱甘肽硫转移酶的融合表达载体pGEX-APAM。将重组质粒转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并进行纯化和肠激酶切割。结果经Western blot鉴定,表达产物具有良好的反应原性。在优化的表达条件下,融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的25.8%,且大部分以可溶性形式存在。纯化的融合蛋白纯度大于95%,每毫克融合蛋白经肠激酶切割后,可得蜂毒明肽58.5μg,回收率为81.9%。结论已成功地原核表达并纯化了蜂毒明肽。     

人Bid蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人Bid基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人Bid基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到588bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid经双酶切鉴定和测序表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约48000,表达量约占菌体总蛋白的50%,纯化后纯度可达97%。结论已成功克隆并原核表达了人Bid基因,得到纯度较高的Bid蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

人血管生成抑制素基因的克隆、表达及纯化

目的 构建携带人血管生成抑制素基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的血管生成抑制素。方法 用PCR法从人纤溶酶原cDNA中扩增出Kringle 1-3基因,克隆入pET21a(+)载体中,在大肠杆菌BL 21中表达,表达产物经亲和层析纯化。结果 所构建的原核表达载体为高效表达系统,所表达的产物经层析纯化后可获得重组人血管生成抑制素。结论 可获得大量纯化人血管生成抑制素,为进一步临床应用奠定基础。     

人BimS蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人BimS基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人BimS基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到327bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-BimS经双酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约37000,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后纯度可达93%。结论已成功克隆并原核表达了人BimS基因,得到纯度较高的BimS蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

P53蛋白的原核表达及纯化

目的构建P53基因重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化。方法以pBabe-P53R质粒为模板,PCR扩增P53基因全序列,克隆至pGEX-4T-1载体中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经不同配比的去垢剂复性后,用GlutathioneSepharose4Bgel亲和层析纯化。结果重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53经双酶切鉴定,表明构建正确。表达的GST-P53融合蛋白相对分子质量约80000,IPTG诱导时间以1h为宜。1%TritonX-100和1mmol/LEDTA为蛋白复性的最佳去垢剂。纯化的GST-P53融合蛋白可与羊抗人GST抗体和鼠抗人P53抗体发生特异性反应。500ml菌液可获得1mg纯化蛋白。结论已成功构建了P53基因重组原核表达质粒,表达并纯化了GST-P53融合蛋白,为研究NIRF与P53基因之间的相互关系奠定了基础。     

植物乳杆菌中胆盐水解酶基因的原核表达及纯化

目的克隆植物乳杆菌中胆盐水解酶(BSH)基因,原核表达并纯化重组蛋白。方法利用PCR技术扩增植物乳杆菌BSH基因,克隆至表达载体pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET-30a-BSH经双酶切鉴定,可见961bp的目的基因条带。表达的重组蛋白相对分子质量约为40000(含6个His标签),主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的43%,纯化后,纯度达90%以上,且可与植物乳杆菌多克隆抗血清发生特异性反应。结论已成功克隆了植物乳杆菌中BSH基因,并在大肠杆菌中获得高效表达。纯化的重组蛋白纯度较高,为高效降解胆固醇的基因工程菌株的研究奠定了基础。     

流感病毒球状头部结构域HA1的原核表达及纯化

目的 原核表达流感病毒（influenza virus,IV）球状头部结构域HA1基因,优化其诱导表达条件,并进行蛋白纯化,以期获得具有良好免疫原性的IV HA1蛋白。方法 将Influenza A virus[A/Saratov/CRIE-250/2017(H3N2)]、Influenza A virus[A/Hebei/F076/2018(mixed)]和Influenza A virus[A/USA/LAN＿(P5)＿HA/2018(H1N1)]进行截短,取63～286头状结构域氨基酸序列,按照大肠埃希菌常用密码子进行优化,合成基因命名为17Sa、Hebei和USA,并对基因17Sa进行点突变命名为基因17Sa变。将4个基因分别克隆至原核表达载体pET-28a（+）,构建重组质粒,将重组质粒转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,优化蛋白表达条件,并利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。结果 成功插入长度为762 bp的目的基因,重组质粒经双酶切（NheⅠ/XhoⅠ）鉴定构建正确。表达的重组蛋白USA相对分子质量约为26 000,17Sa、p17S...     

X盒结合蛋白1-u的原核表达及纯化

目的构建X盒结合蛋白1-u(XBP1-u)基因原核表达质粒,表达并纯化XBP1-u蛋白。方法利用RT-PCR技术从肝癌细胞HepG2中扩增XBP1-u基因,先插入中间载体pGEM-Teasy,再将其克隆至原核表达载体pET32a,构建重组原核表达质粒pET32a-XBP1-u,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果测序分析证实,克隆入pET32a的XBP1-u序列与GenBank中登录的XBP1-ucDNA序列一致。IPTG的最佳诱导浓度为0.5mmol/L,最佳诱导时间为6h。目的蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为33000。纯化的蛋白经SDS-PAGE分析显示单一条带,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了XBP1-u基因原核表达质粒,表达并纯化了XBP1-u蛋白,为XBP1-u在肿瘤发病中的作用机制及在应激性疾病临床治疗中的研究奠定了基础。     

树鼩干细胞生长因子的原核表达、纯化及免疫原性

目的原核表达、纯化树鼩干细胞生长因子(stem cell factor,SCF),并检测其免疫原性。方法根据GenBank预测的树鼩SCF基因序列设计引物,PCR扩增SCF基因,克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-SCF,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经Ni柱纯化后,免疫家兔,Western blot和ELISA法检测其免疫原性,并检测SCF在树鼩不同组织中的分布情况。结果重组表达质粒pET-30a(+)-SCF经酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为34 500,表达量约占菌体总蛋白的35. 6%,以包涵体形式存在;纯化后的重组蛋白纯度达90%以上,可与兔抗人SCF多克隆抗体特异性结合,且免疫原性良好,抗血清效价为1∶256 000。在鼻、气管、肺、脾、肾、食管中能检测到SCF的分布。结论在大肠埃希菌中高效表达了重组SCF蛋白,纯化复性后具有良好的免疫原性。     

结核分枝杆菌复活促进因子E的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌复活促进因子E(RpfE)的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化。方法采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfE基因,双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32a(+)载体连接,转化大肠杆菌Top10。阳性克隆经酶切和DNA测序鉴定正确后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由T7启动子调控表达RpfE蛋白,并对表达蛋白进行鉴定和纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与预期相符,测序结果与文献报道一致。经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,在相对分子质量41000处均可见特异性蛋白条带。经Ni2+-NTA金属螯合层析后,重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功地克隆并构建了RpfE基因的重组表达质粒pET32a(+)-RpfEv,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。     

重组破伤风毒素C片段的原核表达、纯化及其活性

目的原核表达、纯化重组破伤风毒素C片段(rTTC),并进行活性鉴定。方法采用PCR法从破伤风梭菌基因组DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pThioHisA中,构建重组表达质粒rTTC-pThioHisA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。表达的rTTC蛋白经离子交换、凝胶层析两步纯化后,采用Western blot、免疫双扩散及动物免疫试验进行活性及免疫原性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白以包涵体和可溶性形式存在;纯化的重组蛋白纯度大于95%,能与全段破伤风毒素(TT)抗体反应,rTTC抗体能与全段TT反应。rTTC能较好地诱导家兔产生免疫反应,但诱导小鼠产生的免疫反应较弱。结论已原核表达并纯化了rTTC,其有望开发为一种新型抗破伤风芽孢梭菌疫苗及细菌多糖类结合疫苗的蛋白载体。     

慢性粒细胞白血病Bcr/Abl基因OD域融合蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2(lDE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。     

NIRF蛋白的原核表达及纯化

目的 原核表达NIRF基因,并纯化NIRF蛋白。方法 PCR扩增全长NIRF基因,克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用GST 4B球珠亲和纯化目的蛋白。结果重组表达质粒pGST-NIRF经酶切鉴定证明构建正确。22℃条件下培养,菌体A600值达1.8时,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导7 h,能使GST-NIRF在上清中大量表达;纯化的重组GST-NIRF蛋白纯度达85%以上,可与GST抗体和NIRF抗体发生特异性结合。结论已成功在大肠杆菌中表达了GST-NIRF蛋白,纯化的蛋白可用于NIRF的生物功能活性研究。