栉孔扇贝热休克蛋白70基因Cdna的克隆与分析

应用表达序列标签法，获得了栉孔扇贝HSP70基因cDNA的部分序列，然后利用锚定PCR技术克隆到了该基因的全长cDNA。克隆到的HSP70 cDNA全长2553bp，编码区全长1902bp，可以编码634个氨基酸。Blast分析表明该序列与其他生物的HSP70基因具有很高的相似性。在该cDNA序列编码的氨基酸序列中含有3个HSP70家族的特征模体，结合Blast分析的结果，可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝HSP70的编码序列。该基因的克隆为进一步深入研究栉孔扇贝的抗逆机理以及指导扇贝的遗传选育和遗传改良都具有重要的理论意义。     

栉孔扇贝脂多糖葡聚糖结合蛋白(LGBP)基因的克隆及其特征分析

作为模式识别蛋白的脂多糖葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein,LGBP)在无脊椎动物的免疫系统中发挥着重要作用。本研究以鳗弧菌作为病原感染栉孔扇贝,构建全个体cDNA的质粒文库,用T3引物对文库进行随机测序得到一个667bp的cDNA片段(编号：c1305ct320cn336),它与普通蚯蚓的体腔裂解因子前体基因、海胆的β-1,3-葡聚糖酶、非洲疟蚊的革兰氏阴性细菌结合蛋白等有同源性。用T7引物对该克隆测序得到其3’末端。通过SMART-RACE技术克隆得到该克隆的全长cDNA序列。栉孔扇贝LGBP基因由1850个核苷酸组成,它有一个poly A尾巴,编码一条440个氨基酸的多肽。该多肽的分子量估计为47159．076Da,等电点为5．095。推导的氨基酸序列与蓝虾、斑节对虾、海胆、非洲疟蚊、淡水螫虾、普通蚯蚓及普通红蚯蚓等无脊椎动物模式识别蛋白具有高度的同源性。经用Garnier法预测,栉孔扇贝LGBL的二级结构包含螺旋构象10％,折叠片构象17％,转角构象21％,无规则卷曲53％,各种构象所占比例与普通红蚯蚓的体腔裂解因子前体相近。     

栉孔扇贝C型凝集素基因的克隆与表达研究

C型凝集素作为凝集素家族中的主要成员之一,在识别外来微生物表面碳水化合物基团和激活体液中免疫因子等方面具有重要作用。本研究在EST分析的基础上采用锚定PCR方法克隆得到了该基因的全长cDNA。克隆得到的栉孔扇贝C型凝集素cDNA全长1038bp,编码区684bp,可以编码228个氨基酸。在该编码的氨基酸序列中发现了C型凝集素家族的特征模体和一个C型凝集素的结构域(C-type leetin domain,CTLD)。通过Clustalw和SMART分析在该序列中发现了形成二硫键的4个保守的半胱氨酸,与其他物种C型凝集素的二硫键结构非常相似。结合BLAST分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝C型凝集素的编码序列。用RT-PCR技术在鳗弧菌感染前后的血细胞中均可以检测到该基因的表达,但病原刺激前的表达水平相对较低,病原刺激后4h起表达开始升高,并在6h达到最高,随后逐渐开始下降,并于32h恢复到原来水平,该结果表明C型凝集素存在组成型和诱导型两种调控机制,在扇贝防御病原感染的过程中发挥重要作用。     

新型皱纹盘鲍防御素hd-def的cDNA序列分析、基因组克隆及表达研究

从构建的皱纹盘鲍肝肾cDNA文库中筛选到了鲍防御素基因EST.通过序列分析发现该基因的全长cDNA序列编码66个氨基酸残基,其前体由信号肽、前导肽和成熟肽组成.该前体的成熟肽含42个氨基酸(6个Cys),推测分子量为4323Da,等电点为8.02.氨基酸序列同源性分析表明,该多肽与昆虫防御素的相似性较高,最高可达70%.因成熟肽二级结构具有典型的昆虫防御素结构特征,该多肽应属于抗菌肽中的昆虫防御素亚家族,是一种新型抗菌肽,将其命名为鲍防御素hd-def.采用基因组步移法获得了全长4032bp的基因组序列.分析表明,该基因由3个内含子和4个外显子编码组成;3个内含子大小分别为497bp、2357bp和528bp,其中两个内含子存在于编码信号肽的序列中.用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激皱纹盘鲍,能诱导hd-def的表达.实验检测了5种组织,发现hd-def基因仅在肝胰腺中表达,具有明显的组织表达特异性;其表达属于诱导型表达,提示该基因可能参与皱纹盘鲍的抗细菌感染.     

雌核发育银鲫四种孵化酶基因全长cDNA的克隆及其特征分析

用抑制性差减杂交结合SMART cDNA合成和RACE-PCR技术，克隆得到雌核发育银鲫(Carassius auratus gibelio)4种孵化酶基因的全长eDNA。4种孵化酶基因分别被命名为GHEl、GHE2、GHE3、GHE4。序列分析表明，4种孵化酶基因cDNA的开放阅读框均为795bp，都编码265个氨基酸。它们推断的编码氨基酸序列同源性在79．6～95．1％之间。种系分析表明，GHEl、GHE2、GHE3、GHE4的进化地位位于日本鳗鲡(Anguilla japonica)孵化酶和青鳉(Oryzias latipes)孵化酶之间。不同发育时期胚胎的RT-PCR分析表明，银鲫GHEl、GHE2、GHE3、GHE4 4种孵化酶基因从尾芽期到幼苗期都检测到表达，且GHE3和GHE4在神经胚期也检测到表达。各种组织的RT-PCR表明，它们在成鱼组织中不表达。     

外来入侵生物福寿螺β-actin基因片段的克隆及表达分析

采用RT-PCR的方法首次对入侵我国福寿螺的β-actin基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并通过氨基酸序列分析推导与其他相关物种的亲缘关系.结果表明,获得的福寿螺β-actin基因cDNA片段大小为840bp,核酸编码有280个氨基酸序列,与其他物种具有高度的同源性.通过邻接法(NJ)构建的系统发育树显示,福寿螺首先与软体动物聚为一簇,然后与节肢动物聚为一簇,再与脊椎动物聚为一簇.此外,RT-PCR结果显示,β-actin基因在福寿螺的鳃、消化腺、肾和足部肌肉等4个组织内的表达基本一致,具有良好的稳定性.     

节旋藻硝酸盐转运蛋白基因Amnrt P序列分析

应用生物信息学软件对获得的节旋藻硝酸盐转运蛋白基因(Amnrt P)全长序列进行了结构特征、同源性比较、多序列比对、系统发育学分析等.结果表明:该基因全长为1515 个核苷酸,编码 504 个氨基酸,平均 GC 含量为43.8%,疏水氨基酸的比例为47.6%.该硝酸盐转运蛋白含有 12 个跨膜结构域(Transmembrane domains,Tm),膜拓扑结构与 NRT2 家族的类似,并发现了多个 NRT2 家族的保守序列.同源性搜索显示与属于 NRT2 基因家族的海洋蓝藻的氨基酸序列相似性为75%～89%.采用邻接法(NJ)、最大简约法(MP)和最大似然法(ML)构建了分子系统树,结果表明 3 种树的拓扑结构基本相似,并且在蓝藻中基于硝酸盐转运蛋白基因的系统发育关系与形态学分类结果相一致.所获 Amnrt P 基因属于 NRT2 基因家族,可成为蓝藻系统进化研究的分子标记,并为了解节旋藻中硝酸盐吸收与转运的基因结构和分子机制奠定了一定的基础.     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)脱毛蛋白酶基因的克隆与序列分析

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)UN-31-C-42菌株是从成都市生活垃圾中分离,并经多次诱变后得到的菌株。其发酵液具有很好的脱毛效果,且对皮革胶原没有损伤。通过对该菌株发酵液中的碱性蛋白酶DHAP的纯化与N′-末端氨基酸序列测定,以及对该序列的同源性分析后,设计出相应引物,用PCR方法扩增了该菌株的碱性蛋白酶基因AP。测序结果表明,该克隆基因全长1588bp,有一个全长1149bp的编码区序列,推测蛋白质序列长383个氨基酸残基,成熟肽分子量为27．8kD。推测的成熟蛋白酶N′-末端具有与DHAPN′-末端完全匹配的序列,说明克隆到的基因为脱毛蛋白酶基因。同源性分析表明,该基因序列与已报道的其他碱性蛋白酶基因有较高的同源性。     

半滑舌鳎促黄体激素基因克隆和表达分析及其血清浓度测定

利用RACE技术首次克隆了半滑舌鳎脑垂体中促黄体激素(LH)基因cDNA全长序列。该基因全长670 bp,开放阅读框为477 bp,编码158个氨基酸。与其他脊椎动物的LH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明:半滑舌鳎LH与鲽形目和鲈形目同源性高58%～68%。另外,半滑舌鳎LH含有12个保守的半胱氨酸残基和1个N-糖基化位点(19～21 NQT)。实时荧光定量组织表达分析表明,LH mRNA在脑、垂体、卵巢等组织中表达,垂体中表达量最丰富,其他组织尤以脑、性腺表达量较高,推测半滑舌鳎LH可能具有广泛的垂体外生理功能;实时荧光定量PCR方法对繁殖周期雌性半滑舌鳎LH表达水平进行测定,结果表明,LH mRNA在Ⅱ～Ⅵ各繁殖周期的脑、垂体、卵巢3种组织都有表达,但表达水平有差异,在Ⅳ、V期表达量最丰富,说明LH主要促进卵母细胞最终成熟及排卵。利用125I标记的放射免疫测定(RIA)技术检测繁殖周期半滑舌鳎血清LH浓度,结果表明LH在V期含量最丰富,也说明LH主要促进卵母细胞最终成熟及排卵。     

番杏Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆及特性分析

根据同源序列设计筒并引物,通过RT—PCR及RACE的方法从盐生植物番杏中克隆出Na^ ／H^ 逆向运输蛋白基因。序列分析表明,该cDNA全长2199bp,开放读码框为1665bp,可编码一个554个氨基酸的多肽,与其他植物中已经克隆的Na^ ／H^ 逆向转运蛋白具有很高的同源性。系统发育分析表明该蛋白(TtNHX1)与液泡型的Na^ ／H^ 逆向转运蛋白的亲缘较近,与质膜型的Na^ ／H^ 逆向转运蛋白亲缘关系较远。TtNHX1的表达具有组织特异性,在番杏的根、茎和叶中均有表达,而花中没有表达。经NaCl诱导后根、茎和叶中的表达量增加,而花中仍没有表达。     

栉孔扇贝和海湾扇贝病原体感染与疾病发生关系探讨

超薄切片和负染色技术检测栉孔扇贝和海湾扇贝病原体感染状况，结果表明：在栉孔扇贝大规模死亡的7、8月份，病毒检出率分别为80％、100％，此时，病毒感染强度也达到最高；而海湾扇贝整个养殖期间病毒感染率和感染强度均维持在较低的水平，未出现明显的涨落。二种扇贝均检测到类立克次氏体（RLO），但类立克次氏体的感染率和感染强度均未出现明显的涨落，似与扇贝死亡的关系不大。综合分析认为，病毒极可能是导致栉孔扇贝大规模死亡的直接病原。     

华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达

通过3次PCR程序克隆得到了华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶全基因序列,该基因的开放阅读框长1170bp,不含内含子,编码一个389个氨基酸残基的蛋白质,包括26个氨基酸的信号肽,94个氨基酸的前导序列和269个氨基酸的成熟肽,其推断的氨基酸序列与一些已报道的根霉脂肪酶序列同源性为86%.在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中分泌表达前导肽序列.SDS-PAGE分析表明表达蛋白的分子量约37kD.N-端氨基酸序列分析表明该重组蛋白分泌过程中前导序列N-端的67个氨基酸被切割掉,表达的重组脂肪酶由前导序列C-端的27个氨基酸和成熟肽的269个氨基酸组成.发酵132h后上清中重组脂肪酶的表达量最高,蛋白含量约5.4mg/mL,橄榄油乳化法测水解酶活为161U/mL,其比活比野生型华根霉脂肪酶高约43倍.     

东亚钳蝎昆虫毒素BmKIT的cDNA序列分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从东亚钳蝎的尾腺总ＲＮＡ中扩增出挛缩型昆虫毒素ＢｍＫＩＴ的ＣＤＮＡ〈并对其核苷酸序列进行了分析。将含该基因的重组分泌型表达质料ＰＥｘＳｅｃＩ－ＢｍＫＩＴ转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,表达出分泌型的融合蛋白     

雪花莲外源凝集素基因的克隆及其多态性分析

从雪花莲叶片中分离出长度为４８４ｂｐ的雪花莲外源凝集素ｃＤＮＡ,包含了完整的雪花莲外源凝集素编码序列。通过限制性酶切图谱及ＤＮＡ序列分析,从中筛选出５种核苷酸且氨基酸序列均有差别的外源凝集素在１,ＧＡＮ１２,ＧＮＡ１３,ＧＮＡ１４和ＧＮＡ１５。     

节旋藻FACHB341 Rubisco基因部分序列的克隆和分析

以节旋藻FACHB34l为材料，对所克隆Rubisco基因进行了核苷酸序列测定和分析，由此推导出相应的氨基酸序列，并与部分其他蓝藻的同源基因进行了同源性分析。结果表明：所克隆DNA片段包含Rubisco大小亚基基因部分序列及rbcX基因序列，长度为2073bp，其中rbcL和rbcX基因之间存在两个转录茎环结构；大小亚基酸性氨基酸和碱性氨基酸的比例分别为13．14％和14．51％，疏水氨基酸的比例为42．16％；rbcL核苷酸序列与集胞藻PCC6803、Prochlorothrix hallandica、聚球藻PCC630l、Agmenellum quadruplicatum和鱼腥藻PCC7120同源序列的相似性分别为91．7％、79．9％、74．8％、77．2％和76．1％；rbcS核苷酸序列与鱼腥藻PCC7120同源序列的相似性为67．6％，而与PCC630l和集胞藻PCC7002同源序列的相似性分别为30．1％和63．8％。     

斑马鱼ILF2基因的电子克隆分析

利用电子克隆方法,成功获得了ILF2基因在斑马鱼中的同源基因,为进一步研究斑马鱼ILF2基因功能奠定了基础.斑马鱼ILF2基因cDNA全长为1560bp,含有一个编码387个氨基酸的完整开放阅读框架.比较斑马鱼ILF2基因和人ILF2基因,显示两者编码氨基酸序列相似性为87%,核苷酸序列有72%相同.