氮、磷源浓度对裂殖壶菌生长及油脂积累的影响

裂殖壶菌是替代深海鱼油产业化生产二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)油脂的极具潜力的微生物。该研究采用1株裂殖壶菌DP-16发酵产油脂,以葡萄糖为碳源,以酵母浸粉和谷氨酸钠为氮源,以KH₂PO₄为磷源,探究了氮、磷源浓度对菌体生长、葡萄糖消耗和油脂积累的影响。结果显示,在正常氮、磷源浓度下培养菌体,0～24 h为细胞增殖期,24～84 h为油脂积累期,在84 h油脂产量和油脂含量分别达到14.1 g/L和33.5%,84～96 h进入油脂反耗期。改变氮、磷源浓度,低磷条件下72 h的油脂产量和油脂含量分别达到14.8 g/L和44.3%,比对照组分别提高了5.0%和32.2%,而高氮、低氮、高磷等条件均不利于裂殖壶菌产油脂。研究结果表明,氮、磷源浓度对裂殖壶菌细胞生长和油脂积累产生重要影响,油脂产量取决于菌体生物量和细胞内油脂含量的乘积,为提高油脂产量,需要在获得高细胞浓度(生物量)和达到高油脂含量之间找到一个合适的平衡,以确定适宜的氮、磷源浓度。该研究对促进裂殖壶菌发酵产DHA油脂具有重要参考意义。     

糖蜜发酵裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸

对糖蜜作为碳源发酵裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸(docosahexaenic acid,DHA)进行了初步研究:选择不同来源的甘蔗糖蜜与粗糖蜜培养裂殖壶菌生产DHA,考察了糖蜜来源、糖蜜添加比例对裂殖壶菌发酵生物量、菌体油脂含量与DHA含量的影响。结果表明,甘蔗糖蜜中的杂质(灰分、胶体)对菌体生长与油脂积累存在明显的抑制作用,即使大幅降低糖蜜添加比例效果也不理想,限制了其作为替代碳源在实际生产上的应用。在此基础上考察了杂质含量相对较低的粗糖蜜的情况,在添加比例低于80%的情况下,其培养效果与对照葡萄糖非常接近,可以部分替代葡萄糖用于裂殖壶菌发酵生产。     

利用酒糟处理液作为氮源培养裂殖壶菌生产DHA的发酵工艺优化

为降低发酵培养裂殖壶菌生产DHA的成本，以酱香型白酒酒糟为实验材料，将其简单预处理后作为裂殖壶菌发酵培养基氮源，首先分析了酒糟处理液与胰蛋白胨的游离氨基酸组成与含量，然后以生物量、油脂产量和DHA产量为指标，对酒糟处理液、胰蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏作为氮源培养裂殖壶菌生产DHA进行了比较，优化了酒糟处理液作为氮源时的发酵工艺条件，并对发酵废液进行三次循环利用。结果表明：酒糟处理液可以作为满足裂殖壶菌生长的氮源；与酵母提取物、牛肉膏相比，酒糟处理液作为氮源有明显优势；利用酒糟处理液作为氮源的最佳发酵工艺条件为酒糟(含水量约10%)与水质量比1∶9、酒糟处理液添加量70%(与基础发酵培养基中水的置换比例)、初始pH 7.0、培养时间108 h,在此条件下裂殖壶菌生物量、油脂产量和DHA产量分别达到22.14、8.88 g/L和2.84 g/L;最佳条件下三次循环添加15.0%(与基础发酵培养基中水的置换比例)发酵废液于酒糟处理液培养基中，裂殖壶菌DHA产量分别为4.27、3.70 g/L和2.75 g/L。综上，利用酒糟处理液培养裂殖壶菌生产DHA是酒糟资源化利用的新方法。     

利用酒糟处理液作为氮源培养裂殖壶菌生产DHA的发酵工艺优化

为降低发酵培养裂殖壶菌生产DHA的成本,以酱香型白酒酒糟为实验材料,将其简单预处理后作为裂殖壶菌发酵培养基氮源,首先分析了酒糟处理液与胰蛋白胨的游离氨基酸组成与含量,然后以生物量、油脂产量和DHA产量为指标,对酒糟处理液、胰蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏作为氮源培养裂殖壶菌生产DHA进行了比较,优化了酒糟处理液作为氮源时的发酵工艺条件,并对发酵废液进行三次循环利用。结果表明：酒糟处理液可以作为满足裂殖壶菌生长的氮源;与酵母提取物、牛肉膏相比,酒糟处理液作为氮源有明显优势;利用酒糟处理液作为氮源的最佳发酵工艺条件为酒糟（含水量约10%）与水质量比1∶ 9、酒糟处理液添加量70%（与基础发酵培养基中水的置换比例）、初始pH 7.0、培养时间108 h,在此条件下裂殖壶菌生物量、油脂产量和DHA产量分别达到22.14、8.88 g/L和284 g/L;最佳条件下三次循环添加15.0%（与基础发酵培养基中水的置换比例）发酵废液于酒糟处理液培养基中,裂殖壶菌DHA产量分别为4.27、3.70 g/L和2.75 g/L。综上,利用酒糟处理液培养裂殖壶菌生产DHA是酒糟资源化利用的新方法。     

诱变选育高产DHA裂殖壶菌突变株

以裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)为出发菌株,经紫外线、硫酸二乙酯复合诱变和丙二酸、碘乙酸复合平板筛选,获得一株二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)高产菌株XN001。与原始菌株相比,XN001的生物量、油脂和DHA产量分别提高了7.54%、16.65%、48.79%。通过对XN001进行脂肪酸组成分析,其DHA含量达到了脂肪酸的54.25%,提高了26.42%,最终获得的DHA总产量为5.55 g/L,为裂殖壶菌的发酵研究提供了性状优良的菌株。     

裂殖壶菌发酵产DHA油脂的生产工艺优化

采用磷酸香草醛法实时监测裂殖壶菌发酵产DHA油脂的积累情况,对裂殖壶菌的基础发酵工艺进行了优化。得到裂殖壶菌生长和油脂积累的最佳培养基配方为:葡萄糖30 g/L,玉米浆粉6 g/L,蛋白胨4 g/L,硝酸钠3.6~3.9 g/L,海水晶15 g/L;在50 L的发酵罐中采用后期流加一定量的葡萄糖提高碳氮比来提高油脂积累外,通过流加3.0 g/L的大豆油来刺激菌体生长,最终经过72 h的流加培养,菌体湿重达到200 g/L,总油脂含量达到60%以上,油脂脂肪酸组成中的DHA含量占22%左右。     

葡萄糖亚适量补加胁迫裂殖壶菌胞内类胡萝卜素积累

为探究裂殖壶菌积累类胡萝卜素的营养胁迫调控手段,考察了发酵中期(72 h起),不同葡萄糖补加质量浓度、酵母提取物补加质量浓度对裂殖壶菌生长、油脂合成和类胡萝卜素合成的影响。结果表明:仅补加较低质量浓度葡萄糖时,裂殖壶菌生物量和油脂产量虽较低,但胞内类胡萝卜素含量较高;在5 L发酵罐中、发酵中期,采用溶氧反馈控制葡萄糖流加策略,人为制造葡萄糖亚适量补加条件,在发酵98 h时胞内类胡萝卜素含量达到最大,为151.0μg/g,相比葡萄糖充足供应条件下的水平提高了4倍以上。综合发酵实验结果和裂殖壶菌代谢途径分析,可推测:油脂合成期葡萄糖亚适量补加可限制细胞生长、弱化裂殖壶菌胞内油脂合成途径,胁迫碳源流向类胡萝卜素合成途径,促进类胡萝卜素的大量积累。     

不同碳氮源浓度和培养温度对裂殖壶菌产DHA的影响

研究不同碳氮源浓度和培养温度对裂殖壶菌产DHA的影响。用干重法测定裂殖壶菌的生物量,溶剂法提取油脂,并用GC分析DHA含量。结果表明:最适初始葡萄糖质量浓度和氮源质量浓度分别为80、15 g/L;菌种在26℃下培养48 h后,再将发酵温度降到22℃下培养120 h,其DHA含量为43.62%,DHA产量为5.23 g/L。在最佳条件下,50 L放大培养(先26℃培养48 h,后22℃培养96 h)后油脂产量可达14.8 g/L,DHA产量可达6.5 g/L。综上所述,裂殖壶菌具有较好的工业化生产潜力。     

EMS-ARTP复合诱变选育高产DHA裂殖壶菌

为确定一种高效、稳定的选育高产DHA裂殖壶菌菌株的方法,将出发菌株Schizochytrium sp.31进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变和常压室温等离子体(ARTP)复合诱变,并将复合诱变方法与2种单因子诱变方法进行诱变效率、诱变后高产株发酵特性及遗传稳定性比较。结果显示,该复合诱变正突变率达到32.2%,远高于2种单因子诱变方法;复合诱变选育得到高产DHA裂殖壶菌菌株,其DHA生产能力和DHA含量分别达到7.2g/L和43.2%,比出发菌株分别高35.6%和19.2%;经过5代培养,其发酵指标稳定,遗传稳定性优于单因子诱变获得的菌株。该复合诱变方法是选育高产DHA裂殖壶菌菌株的有效手段,也为其它产多不饱和脂肪酸菌株的选育提供了参考。     

生物柴油副产品粗甘油浓度对裂殖壶菌生长与积累油脂的影响

在研究了生物柴油副产品粗甘油培养裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)WZU6961产油脂的优化培养条件的基础上,对粗甘油浓度对裂殖壶菌生长和积累油脂的影响进行研究。结果表明,在温度、溶氧及培养基其他成分相同的培养条件下,随着粗甘油浓度的增加,菌体油脂含量和脂肪酸组成没有显著的变化;但甘油的生物量和油脂得率系数以及生物量生产率和油脂生产率逐渐下降,说明粗甘油浓度过高对细胞的生长有抑制效应;当粗甘油质量浓度分别为30 g/L和60 g/L时,生物量生产率分别为0.94 g/(L·h)和0.87 g/(L·h),油脂生产率分别为0.69 g/(L·h)和0.64 g/(L·h),两者的生物量生产率和油脂生产率比较接近,因而可以得出适宜的粗甘油质量浓度为30 g/L。在粗甘油质量浓度30 g/L下,发酵时间26 h,生物量、菌体油脂含量和DHA占油脂的比例分别为(24.38±1.42)g/L、(74.08±2.20)%和23.72%。