组合策略促进碱性果胶酶在毕赤酵母中高效表达

本研究组合了基因密码子优化及分子伴侣共表达策略提高碱性果胶酶(PGL)在毕赤酵母中的胞外产量。基于Pichia pastoris密码子偏好性,优化了来源于Bacillus sp.WSHB04-02 PGL高热稳定性突变体K314M基因,并克隆至pPIC9K的Eco R I-Not I得到PGL表达载体p PIC9K-PGL。p PIC9K-PGL转化Pichia pastoris GS115(his-)得到重组菌GS115/PGL 14#,胞外PGL酶活达到301.32 U/mL,较优化前提高25.1%。在此基础上,分别及同时共表达分子伴侣内质网蛋白折叠氧化还原辅助因子(ERO1)和泛素共轭酶(UBC1)。结果显示,同时表达ERO1和UBC1(GS115/PGLl-ERO1-UBC1 2#)使重组菌胞外PGL较共表达前提高49.3%,达到450.12 U/mL。应用指数流加策略对重组菌株GS115/PGLl-ERO1-UBC1 2#进行3 L罐发酵,诱导发酵96h胞外PGL可达1 362.31 U/mL。研究结果对促进PGL产量的提升及其应用具有重要现实意义。     

共表达HAC1基因对重组毕赤酵母分泌表达葡萄糖氧化酶的影响

通过增强不可折叠蛋白质响应(UPR)信号途径以及研究不同培养温度下的影响,来提高重组葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的分泌表达。影响毕赤酵母外源蛋白表达的因素,主要为内质网中的折叠速率以及不可折叠蛋白积累造成的胞内胁迫压力。通过共表达HAC1基因对不可折叠蛋白信号通路进行调控,摇瓶中改造菌株PP-G-HAC1胞外酶活达到161 U/m L,相比于原始重组葡萄糖氧化酶菌株提高了34%。进一步研究不同温度下过量表达HAC1基因对菌株的生长和分泌外源蛋白的影响,菌株PP-G-HAC1在3 L发酵罐中28℃培养,酶活达到1 008 U/m L,胞外重组蛋白质达到14.43 g/L,相比原始菌株在相同条件下提高了3.12倍。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达

为大规模制备β-葡萄糖苷酶,构建重组酵母工程菌,实现β-葡萄糖苷酶的分泌表达。根据已报道黑曲霉(Aspergillus niger)β-葡萄糖苷酶cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR扩增,获得黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl)。构建了pMD-18T-bgl克隆载体,bgl亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-bgl。经BglⅡ线性化后电转入Pichia pastoris GS115,经过MD、YPD/G418平板筛选阳性克隆,获得分泌表达重组P.pastoris GS115的工程菌。用终体积分数1%的甲醇对其进行诱导表达,SDS-PAGE和酶活测定结果表明,重组毕赤酵母分泌了1个相对分子质量约90 000的蛋白质,与该酶基因产物的理论值一致。酶催化的最适温度为50℃,最适pH 5.5,其酶活达到38 U/mL,比已报导重组酶产酶水平有较大程度的提高。     

采用组合策略提高灰色链霉菌胰蛋白酶在毕赤酵母中的表达

胰蛋白酶是一种重要的工业酶,广泛应用于皮革加工、食品加工和医药等领域。该研究从菌株改造及发酵条件优化两方面提高了灰色链霉菌胰蛋白酶(Streptomyces griseus trypsin, SGT)在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的发酵产量。首先,分析了4种分子伴侣(Cne1、Bmh2、Ssa4和Vhb)和2种转录因子(Yap1、Aft1)对SGT在P.pastoris GS115中表达的影响。摇瓶发酵结果显示,与转录因子Aft1共表达时SGT酶活力较对照菌提高了19.71%,达到217.30 U/mL;其他转录因子或分子伴侣的共表达降低了SGT产量。其次,确定了菌株PP-SGTm/Aft1的最适生长pH和最适诱导pH分别为5.5和6.5。最后,优化了PP-SGTm/Aft1在5 L罐中诱导产酶过程中流加混合碳源(甲醇-山梨醇)的比例。结果显示,当补加的m(甲醇)∶m(山梨醇)=20∶0.5时,5 L罐SGT酶活力达到了2 667.24 U/mL(144 h),较仅流加甲醇酶活力提高了20.1%。研究结果将为SGT工业化发酵生产提供重要基础数据。     

红平菇漆酶基因异源表达及对染料脱色的研究

以白腐菌红平菇Pleurotus djamor RNA为模板,通过RT-PCR得到漆酶Pd-lac1基因的完整CDS序列。构建毕赤酵母表达载体pPICZB-Pd-Lac1,并通过电转化法导入Pichia pastoris中,通过PCR结果证明,Pd-lac1的CDS序列部分阳性转化子已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上,经摇瓶液体培养后筛选出蛋白表达较高的酵母工程菌株。漆酶活力达54 U/L。进而研究了重组漆酶对染料脱色的影响。结果表明：重组漆酶对蒽醌类SN4R脱色可达52.8%;杂环类中性红、偶氮类甲基橙和三苯基甲烷类孔雀绿的脱色率低于SN4R,脱色率分别为14.8%、14.5%、0.24%,显示出重组漆酶对SN4R脱色效率具有较大的应用潜力,从而对废水处理具有更广的应用前景。     

门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina P10脂肪酶基因的克隆及其在酵母中的表达

采用同源克隆法获得了门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina P10脂肪酶基因的全长序列,DNA测序结果表明,该基因的DNA全长序列为801bp,编码267个氨基酸,推测蛋白相对分子量为29.95ku。将该脂肪酶基因连接到pPICZαA载体上得到重组表达质粒,转化Pichia pastoris X-33。脂肪酶基因在Pichia pastoris X-33中实现了分泌性表达,摇瓶发酵液上清酶活最大可达8U/mL。      

Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中分泌途径的鉴定及其分泌能力的提高

食品安全（GRAS）菌株枯草芽孢杆菌由于其具有良好的分泌表达能力及易于基因工程操作等特性被广泛用作外源蛋白质的表达菌株。枯草芽孢杆菌中蛋白质的分泌大多依赖于信号肽介导的Sec分泌途径（General secretion pathway）和Tat分泌途径（Twin-arginine translocation pathway）。在本研究中,通过信号肽预测、蛋白质N端测序等手段发现来自于Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌并不依赖信号肽,该酶通过非经典蛋白质分泌途径（non-classical protein secretion pathway）进行分泌。通过信号肽筛选,发现最适合该酶在枯草芽孢杆菌中表达的信号肽为Tat分泌途径信号肽SP_phoD,并通过共表达分子伴侣PrsA的方式将该L-天冬酰胺酶的分泌量提高了72.11%。     

多拷贝脂肪酶基因在黑曲霉中表达研究

前期通过分泌蛋白质谱分析和转录组测序,确定了一株高产漆酶的白腐菌为灵芝,其分泌漆酶的编码基因为lcc1。本研究PCR扩增lcc1基因的基因组序列（lcc1-D）和cDNA序列（lcc1-C）,分别构建表达载体（pSZH6R-lcc1-D、pSZH6R-lcc1-C）。通过农杆菌介导法转化黑曲霉TH-2,筛选出在糖化酶基因glaA位点发生同源重组的纯合黑曲霉转化子。摇瓶发酵后取发酵液上清进行Native-PAGE检测和酶活测定,结果表明,重组菌株lcc1-C的漆酶表达量和酶活力高于lcc1-D,酶活力最高值分别为431.94 U/L和218.06 U/L。Real-time PCR结果表明,lcc1-C中的漆酶mRNA水平是lcc1-D的3.38倍。对重组漆酶进行酶学性质分析,发现其最适反应温度为60 ℃、最适pH为3.5。在染料脱色实验中发现重组漆酶对孔雀石绿、中性红、甲基橙具有明显脱色作用,介体存在时能增强漆酶对染料的脱色效果,对中性红脱色效率最强,48 h脱色率可达到91.21%。为改善重组漆酶的折叠,向重组菌株lcc1-C的发酵培养基中添加渗透调节剂,结果显示,在添加0.4 mol/L TMAO时酶活力达到1301.67 U/L,提高了1.97倍;在添加0.5 mol/L脯氨酸时酶活力达到2037.22 U/L,提高了3.64倍;在添加0.5 mol/L甘氨酸时酶活力达到1434.03 U/L,酶活力提高了2.27倍。     

嗜热酸性普鲁兰水解酶Ⅲ的高效分泌表达及其酶学性质

本研究旨在通过共表达分子伴侣蛋白以及优化发酵条件来提高III型普鲁兰水解酶（TK-PUL）在短小芽孢杆菌中的分泌表达水平。通过构建共表达TK-PUL和分子伴侣蛋白的多种重组短小芽孢杆菌,并以胞外酶活为指标对其进行筛选,确定最有利于TK-PUL分泌表达的分子伴侣蛋白及对应的重组短小芽孢杆菌。在此基础上采用单因素实验和响应面法优化重组短小芽孢杆菌的发酵条件。结果表明,共表达分子伴侣蛋白PrsA^Ba的重组短小芽孢杆菌的胞外酶活达到98.79 U/mL,提高了0.31倍。该重组短小芽孢杆菌的最佳培养基包括19.65 g/L 葡萄糖、21.46 g/L 酵母提取物、12.01 g/L MgCl₂·6H₂O、9.02 g/L 脯氨酸、0.01 g/L FeSO₄·7H₂O、0.01 g/L MnSO₄·4H₂O、0.001 g/L ZnSO₄·7H₂O。在发酵温度为35 ℃、起始发酵pH为7.0的条件下,该重组短小芽孢杆菌于最佳培养基中培养66 h时,其胞外酶活达到192.68 U/mL,提高了1.56倍。本研究通过共表达分子伴侣蛋白和发酵优化实现了TK-PUL在短小芽孢杆菌的高效分泌表达,为TK-PUL的应用提供了基础。

     

雅致放射毛霉羧肽酶Y在毕赤酵母中的高效分泌表达

分别构建以2种启动子表达雅致放射毛霉羧肽酶Y的重组毕赤酵母菌株GS115,通过提高抗生素浓度筛选到具有不同拷贝数羧肽酶Y基因的重组菌株,通过对蛋白表达量的比较筛选出高效分泌表达菌株。在筛选得到的重组菌株中共表达伴侣蛋白binding protein(BIP)、protein disulfide isomerase(PDI)、endoplasmic oxidoreductin 1(ERO1),分别将羧肽酶Y酶原的分泌表达量提高到1. 87倍、1. 72倍和1. 26倍。体外羧肽酶Y酶原可以由胰蛋白酶激活。该研究实现了雅致放射毛霉羧肽酶Y在毕赤酵母中的高效分泌表达,为其工业化应用提供了技术支持。