马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3的毒理学安全性评价

为评估马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3食用安全性及健康风险,对ZW3进行系统的体外和体内毒理学实验,包括SD大鼠急性经口毒性实验、细菌回复突变实验、小鼠骨髓细胞微核实验和仓鼠卵巢细胞染色体畸变实验。急性经口毒性实验表明：ZW3的LD50大于10.0 g/kg体重;细菌回复突变实验结果显示：ZW3对5株测试菌株无诱变特性,在小鼠骨髓细胞微核实验中ZW3不会导致哺乳动物嗜多染红细胞含微核细胞率增加;仓鼠卵巢细胞染色体畸变实验结果表明：ZW3的不同剂量组中染色体异常细胞和染色体畸变率均与阴性对照组无明显差异。综合评价,马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3属于实际无毒级,并且不存在遗传毒性、致突变和致癌性。     

马乳酒样乳杆菌ZW3对酸奶风味及质构的影响

将马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3（Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens ZW3）与常用的酸奶发酵剂嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌共同发酵,旨在制备酸奶时,不添加任何增稠剂和乳化剂,而是通过乳酸菌的发酵作用,增加酸奶的黏度和适口性。结果表明,ZW3可以缩短酸奶发酵时间,提高持水力,减少乳清析出,增加黏度,改善流变学特性,增加酸奶的硬度、胶着性、咀嚼性、内聚性和恢复性,电子鼻分析及感官评价结果表明,ZW3可提高酸奶中挥发性风味物质的含量,改善酸奶风味及口感。     

马乳酒样乳杆菌ZW3多位点序列分型

该研究采用多位点序列分型方法将马乳酒样乳杆菌ZW3与其他同种或近源乳杆菌菌株进行细致的分类鉴定,同时确定马乳酒样乳杆菌ZW3特定的生物遗传标签,使用多位点序列分型方法对马乳酒样乳杆菌ZW3菌株与9株同种或近源乳杆菌一起进行多位点序列分型研究。该研究选取了7个管家基因(rpo A、Hsp60、Leu S、rps B、gly K、pyr G、fus A)对这10株同种或近源乳杆菌菌株进行分型,最终得到8个序列型,马乳酒样乳杆菌ZW3单独拥有一个序列型ST8。这7个基因中,除pyr G外其余6个基因存在连锁不平衡现象,发生过轻微的基因重组现象,发生的变异通常为中性选择。马乳酒样乳杆菌ZW3与马乳酒样乳杆菌an3、shan3、shan4、shan5之间的遗传距离很近,与另外5株菌之间的遗传距离较远。该研究中选取的这7个管家基因可以将马乳酒样乳杆菌ZW3与其他同种或近源乳杆菌菌株进行区别,马乳酒样乳杆菌ZW3菌株的识别有助于在商业制品中确定其特定的益生功能。     

一株马乳酒样乳杆菌胞外多糖的理化性质

ZW3胞外多糖是由分离自西藏开菲尔粒中的马乳酒样乳杆菌马乳酒亚种ZW3分泌产生,文中针对此多糖进行了理化特性的分析与表征。实验中,傅立叶变换红外光谱表明此多糖存在羧基、羟基和酰胺基,与典型的异型多糖结构相一致。气相色谱分析表明此多糖仅由半乳糖和葡萄糖构成。ZW3胞外多糖絮凝能力与黄原胶相似,比瓜尔胶的絮凝能力要强。相对于商业用途亲水胶体黄原胶、瓜尔胶和刺槐胶来说,ZW3胞外多糖具有更强的乳化能力,因此它具有作为商业用乳化剂的潜力。以上特性表明ZW3胞外多糖在工业应用方面特别是食品工业上拥有广阔的前景。     

马乳酒样乳杆菌ZW3基因WANG_1108的特性及功能

为分析马乳酒样乳杆菌ZW3（Lactobacillus kefiranofaciens ZW3）的一株突变株2#胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）产量下降的原因。对突变株2#进行基因组重测序后与野生菌ZW3全基因组比对,分析突变基因在代谢通路中EPS产量的相关性;利用实时荧光定量-聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR）技术分析可能会与多糖产量相关的突变基因的相对表达量;构建含有表达量变化明显基因的重组质粒转至大肠杆菌并测定其酶活性,探究突变基因与产糖量的关系。结果经全基因组分析比对,野生菌株ZW3与突变株2#在CDS区和启动子区发生突变的基因共60?个,其中相关催化反应酶类基因有6 个,分别为：WANG_0173、WANG_0174、WANG_0175（3 个基因均为编码二羟丙酮激酶亚基部分）、WANG_0292（β-半乳糖苷酶小亚基）、WANG_0840（UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸/D-谷氨酸连接酶）、WANG_1108（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）,其中WANG_0292发生了同义突变。RT-qPCR分析突变基因相对表达量,发现突变株WANG_1108基因相对表达量下降明显,选取WANG_1108进一步阐明与多糖产量的关系;成功构建重组表达载体pET28a-ZW3/2#-1108、并转至表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）,诱导蛋白表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳酶活性测定结果显示,突变株中酶活性比野生菌降低了37%。由此推测基因WANG_1108的突变是影响突变株产糖量下降的原因之一。     

马乳酒样乳杆菌（XL10）的分离、鉴定及对小鼠肠道菌群的影响

以西藏开菲尔粒为原料,从中筛选出一株马乳酒样乳杆菌XL10,对其进行鉴定及生长特性研究;并以小鼠为研究对象,观察XL10对小鼠肠道菌群的影响。结果表明XL10菌株能够促进小鼠肠道有益菌生长,抑制有害菌繁殖。结果表明XL10菌株具有能够调节肠道菌群平衡,保护肠道健康的潜能。     

植物乳杆菌的DPO引物实时荧光PCR检测方法

根据已报道的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的23S rRNA基因保守序列,设计用于检测植物乳杆菌的特异性DPO(dual priming oligonucleotide)引物,结合SYBR GreenⅠ实时荧光PCR技术,建立植物乳杆菌的DPO引物实时荧光PCR检测方法,对其特异性和灵敏度进行了评价,并将建立的检测方法用于实际样品的检测中。结果显示,该方法对2株植物乳杆菌能得到阳性扩增,其余11株乳酸菌及阴性对照没有扩增曲线,灵敏度高达0.001 ng/μL,而且在退火温度为50~60℃范围内不影响其特异性,表明该方法对退火温度不敏感;用微生物菌制剂和酸奶共13种益生菌产品进行了验证,检出情况与产品标识一致。因此,该研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR能够快速、准确、高效地检测微生物菌制剂及其他益生菌产品中的植物乳杆菌。     

实时荧光定量PCR法测定发酵乳中双歧杆菌

对实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测发酵乳中双歧杆菌的DNA提取方法、PCR扩增效率、标准曲线绘制进行探讨,通过比较分析碱式提取法、玻璃珠破碎法和酶解法3种提取方法对发酵乳中总DNA提取效率、4种不同参考菌株的PCR扩增效率以及单一菌株标准曲线与混合菌株标准曲线的计数结果,建立实时荧光定量PCR快速测定发酵乳制品中双歧杆菌数量方法。结果表明：酶解法提取发酵乳中总DNA效果最好,OD260/280比值基本接近1.80,且提取的质量浓度含量最高;不同菌株的PCR扩增效率不同,其中参考菌株1.2213的Ct值与其他3菌株的Ct值存在显著性差异;根据单一菌株绘制标准曲线与混合菌株绘制标准曲线计数结果无显著性差异,后者计数结果更客观、准确。采用酶解法获取样品中的菌体细胞,基于混合菌液绘制标准曲线,采用实时荧光定量PCR技术确定发酵乳中双歧杆菌种属数量,可快速、准确地测定发酵乳中双歧杆菌的数量。     

3种致病菌多重real-time PCR检测方法的建立及其在散装即食肉制品中的应用

建立一种同时快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的三重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法.以沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌Sa442基因和蜡样芽孢杆菌Cereolysin AB基因为靶基因设计引物和TaqMan探针...     

一种5 重real-time PCR筛查转基因水稻方法的建立

以转基因水稻中最常用的CaMV35S启动子、NOS终止子、Cry1Ab/Ac基因、HPT基因及SPS水稻内标基因为研究对象，利用5 种不同的荧光信号（FAM、HEX、Taxas Red、Cy5、Cy5.5）进行多重实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）检测方法的研究。通过引物组合筛选、反应体系优化、特异性测试、灵敏度测试、适用性测试等一系列实验，建立了5 重real-time PCR方法，灵敏度可达0.032%。此方法具有灵敏度高、结果准确、通量大等优点，可实现水稻中转基因成分的快速、高效检测。     

鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平快速定量方法的建立及应用

目的 应用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-timefluorescencequantitativepolymerasechainreaction,qPCR),建立鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平的快速定量检测方法。方法 通过比对鼠李糖乳杆菌HN001的近缘菌株的基因组,筛选出鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平的特异基因,以菌株水平的特异基因为靶标设计引物及探针,优化反应体系和条件,建立鼠李糖乳杆菌HN001株水平的q PCR检测方法。对方法的特异性、灵敏度、检出限进行验证,并采用已建立的q PCR方法进行模拟添加样品和实际样品的检测。结果 所建立的方法特异性强,与近缘菌株无交叉反应,鼠李糖乳杆菌HN001纯培养液检出限为102 CFU/mL,灵敏度可达到650 copies/μL,可在2h内完成样品检测。对模拟添加样品以及实际样品检测中q PCR和平板计数法结果的对数值进行显著性分析检验,两种方法的测定值结果均无显著性差异(P>0.05)。结论 本研究建立的q PCR检测方法可有效应用于益生菌产品中鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平定量检测,具有快速、灵敏、准确的特点。     

啤酒腐败菌耐乙酸乳杆菌种特异性检测体系的建立与应用

以耐乙酸乳杆菌的3个特异性基因为靶标,设计并优化了3对耐乙酸乳杆菌的特异性引物,建立了基于SYBR GREEN实时荧光定量PCR的耐乙酸乳杆菌定性定量检测的标准检测(standard operation procedure,SOP)方法。利用耐乙酸乳杆菌CN247的基因组DNA作为标准品绘制了标准曲线,实现了对耐乙酸乳杆菌的定量检测,耐乙酸乳杆菌的最低检测限可达100 CFU/m L,精度可达10 CFU/m L。大生产样品在培养基中富集培养48 h后即可满足检测的要求,检出率为100%,整个检测时间控制在3 d以内,满足了啤酒企业对出厂产品快速检测的质量控制要求。     

多重real-time PCR技术快速鉴别特种乳中的乳源动物成分

建立一种特种乳中乳源动物成分快速鉴别多重实时聚合酶链式反应技术。通过筛选建立8?种不同乳源物种检测的多重实时聚合酶链式反应方法,在一个反应体系里可同时检测4?种乳源的特异性靶基因,绝对灵敏度达0.1～5?pg/μL,检出限可达0.1%。同时,建立了高效的DNA提取方法,样品裂解后可在12?min左右完成96?个样品的DNA提取,大大缩短了样品前处理时间。采用该方法对市售特色乳产品进行调查,结果显示标识不准确的产品比例达36.36%。     

一种副干酪乳杆菌快速鉴定方法的建立及应用

目的：基于肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应技术（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction,ERIC-PCR））,寻找并制备一对引物探针,灵敏、准确地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。方法：寻找副干酪乳杆菌HP-B1145的肠杆菌基因间重复一致序列（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus,ERIC）最佳反应体系,对ERIC片段回收纯化得到特定条带及序列结果,据此设计引物,快速鉴定副干酪乳杆菌。结果：根据回收得到的副干酪乳杆菌HP-B1145 ERIC片段,设计出了一对引物探针（1145-S-F:5’-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3’;1145-S-R:5’-CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3’）。结论：根据引物特异性、准确性、普适性、含量限度实验得出,设计的引物能准确灵敏地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。     

实时荧光定量PCR法鉴定婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种

该研究通过系统发育树分析确定目标基因,并设计引物和探针,建立一种婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）的实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-fqPCR）鉴定方法。通过特异性、灵敏性和抗干扰实验对该方法进行验证,并对市售的64份标识含有动物双歧杆菌乳亚种的婴幼儿配方乳粉样品进行检测。结果表明,atpD基因在动物双歧杆菌乳亚种间具有较高的种间特异性,种间差异率＞10%,确定其为目标基因。基于该基因建立的RT-fqPCR方法能够特异性的检测动物双歧杆菌乳亚种,检测绝对灵敏度可以达到1 pg/μL,相对灵敏度可以达到103 CFU/mL;基因水平和培养物水平抗干扰能力良好。采用该方法从64份标识含有动物双歧杆菌乳亚种的乳粉样品中均能检测出动物双歧杆菌乳亚种,表明基于atpD基因建立的RT-fqPCR方法能够快速准确的对动物双歧杆菌乳亚种进行检测。     

干酪乳杆菌鼠李糖亚种与肉葡萄球菌在大豆奶酪中的应用研究

研究了干酪乳杆菌鼠李糖亚种（Lactobacillus rhamnosus）与肉葡萄球菌（Staphylococcus cafnosus）在豆乳中的生长、产酸和凝乳的能力,结果表明,L．rhamnosus与S．cafnosus适合在豆乳中生长并具有很强的产酸和凝固豆乳的能力,2菌种之间没有相互抑制作用,当二者组合发酵3h时可使豆乳凝固;大豆发酵乳的SDS—PAGE、氨基氮分析及大豆乳清中蛋白质含量分析表明2菌种对蛋白质的降解没有显著性差异;质构分析表明菌种S．carnosus能明显降低大豆奶酪的硬度。     

分子生物学技术在双歧杆菌检测中的应用

从核酸探针、聚合酶链式反应、分子标记、实时PCR等分子生物学技术在双歧杆菌检测中的应用等方面作以综述，并指出各种检测技术的局限性及应用前景。     

S．Heidelberg血清型特异性基因筛选及PCR检测方法的建立与应用

海德尔堡沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Heidelberg,SH)是沙门氏菌属内重要的致病性血清型。通过对SH基因组序列进行BLAST比对和PCR验证,筛选出了4个SH血清型特异性基因(SeHA_C2639、SeHA_C2640、SeHA_C3259和SeHA_C3258)。以SeHA_C3258作为靶点设计引物pHAm8(350bp)和沙门氏菌属特异性引物139-141(284bp),建立SH的PCR检测方法,并对其应用效果进行评价。结果表明,经55株不同血清型的沙门氏菌和其他常见食源性致病菌证明,该检测体系具有较好的特异性,纯菌菌落灵敏度为6.1×10~2 CFU/mL。以浓度为N×10~5~N×10~1 CFU/mL的大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌为干扰菌时,该体系对10~2 CFU/mL的SH检测结果无影响。人工污染SH的牛奶样品,经8h培养,检测限达1.52CFU/mL。该检测方法能快速、准确检测出食品中的SH,有利于在食品安全领域中的应用。     

4种动物源性成分多重real-time PCR检测方法的建立及其在驴肉制品检测中的应用

建立一种同时快速检测驴、马、猪及鸭源性成分的四重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。分别以4种源性成分的Nad5、ATpase6、ATP8、cytb基因为靶基因设计特异性引物和Taq Man探针,以18S r RNA基因为内参基因,建立多重real-time PCR方法,并对该方法进行方法学验证,同时对不同掺入比例模拟样品、不同加工工艺模拟样品和实际驴肉样品进行检测。结果显示,该方法具有高通量、特异性强、灵敏度高等优点。当Ct值≤35.0时,方法对16种非目标源性具有良好特异性;灵敏度可检测到质量浓度为2×10^-4 ng/μL的模板DNA;对生肉的检出限为肉含量的0.001%,对熟肉制品的检出限为肉含量的0.01%;对100份实际样品进行检测,结果与标准方法一致,说明建立的多重real-time PCR法可用于肉及肉制品中常见掺假源性成分的检测。     

芝麻过敏原PCR检测方法

芝麻是重要的食品过敏原之一,微小剂量即可引起严重的过敏反应。针对芝麻过敏蛋白-2S白蛋白的基因序列设计PCR扩增引物,建立并优化芝麻过敏原检测的普通聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)方法。结果表明,两种方法的最低检测限分别为0.1,0.01ng DNA,该方法特异性良好,成本较低,具有一定的应用价值。