中性蛋白酶基因在大肠杆菌中诱导表达条件的研究

采用PCR方法从枯草芽孢杆菌中扩增得到中性蛋白酶基因npr,与表达载体pET-22b(+)连接构建成重组质粒pET22b-npr,转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌株。经IPTG诱导,其所含有的中性蛋白酶基因可高效表达。研究不同的表达条件对中性蛋白酶表达水平的影响,发现当培养液的OD_(600)值达到0.6～0.8时,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.8 mmol/L,28℃诱导7h,重组工程菌中性蛋白酶的表达量最高,SDS-PAGE电泳结果显示出明显的分子质量约43 ku的特异性蛋白条带。     

噬夏孢欧文氏菌crtY基因在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化

噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)可以累积类胡萝卜素,合成过程涉及的一系列反应都是在相关酶的催化下完成的,其中番茄红素环化酶由基因crtY编码,催化由番茄红素转化为β-胡萝卜素的酶促反应。本研究以噬夏孢欧文氏菌基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应扩增获得crtY基因,测序正确后克隆进表达载体pET-15b,构建表达质粒pET-15b-crtY,重组质粒转化E．coli BL21(DE3),构建工程菌,经IPTG诱导后,重组番茄红素环化酶在大肠杆菌中实现了高效表达,通过镍离子树脂亲和层析和Superdex 75凝胶过滤层析,得到了电泳纯的重组噬夏孢欧文氏菌番茄红素环化酶,该蛋白体外具有催化番茄红素转化为β-胡萝卜素的活性。     

乳糖诱导对重组大肠杆菌表达CGTase的影响

以重组环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)表达菌株BL21(DE3)作为研究对象,比较IPTG和乳糖诱导对重组大肠杆菌表达CGTase量的影响,确定优化诱导方式。以Geobacillus CHB1的基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆CGTase基因;利用分子操作技术构建携带有大肠杆菌Omp A信号肽的分泌型表达质粒p EASY-E2-Omp A-CGT,重组质粒热激转化至Escherichia coli BL21中进行表达;在摇瓶发酵条件下,分别以IPTG和乳糖作为诱导剂,通过SDSPAGE分析和测定胞外酶活,确定优化诱导方式。CGTase基因在Escherichia coli BL21中实现表达,且具有一定量的重组CGTase分泌至胞外;乳糖诱导的蛋白表达量优于IPTG诱导,不易形成包涵体;乳糖最佳的诱导起始菌浓度OD600为1.4,诱导浓度、温度分别为0.5%和25℃,分批流加乳糖5次和一次性加入,重组CGTase表达量无明显差异;经初步优化,胞外酶活达19.87 U/m L。Geobacillus CHB1 CGTase基因在大肠杆菌中成功实现胞外表达,乳糖可替代IPTG诱导重组CGTase。     

乳源性免疫活性肽在E.coli BL21中分泌表达的诱导条件优化

设计4个乳源性免疫活性肽的目的基因后,利用基因重组技术成功构建原核表达载体pTYB11,并将重组质粒转化到E.coli BL21中,通过改变异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)的浓度、培养时间和培养温度,设计正交试验来优化乳源活性小肽的IPTG诱导表达条件,使目的蛋白可在E.coli BL21中高效表达。依据15% SDS-PAGE电泳分析得到融合蛋白的表达量,选出最适诱导条件为IPTG终浓度0.1～0.2mmol/L,在12～15℃条件下培养20h,得到大小为59.2kD左右的融合目的蛋白,其表达量可占总蛋白表达量的40%,经Western Blotting鉴定正确。     

人甲胎蛋白AFP在大肠杆菌中表达和鉴定

本研究通过应用基因工程技术,重组构建编码人全长甲胎蛋白AFP基因的原核表达载体pET22b-AFP,并将其转化到大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达目的蛋白AFP。采用PCR法扩增编码AFP蛋白的cDNA序列片段,并将其克隆到含有His-tag的pET22b原核表达载体上;重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达;对诱导过程中不同浓度的IPTG和不同的温度进行优化;选定最佳的优化条件进行诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE电泳和Western Blot法鉴定表达产物。结果表明,通过PCR扩增技术获得了编码AFP蛋白的基因片段;重组质粒经双酶切和基因测序等方法鉴定后,确认了重组质粒已经构建成功;表达产物通过利用SDS-PAGE和Western Blot法检测到在66 kDa附近出现条带,与预期值相符,表明重组AFP蛋白已成功表达。     

人甲胎蛋白 AFP 在大肠杆菌中表达和鉴定

本研究通过应用基因工程技术,重组构建编码人全长甲胎蛋白AFP基因的原核表达载体pET22b-AFP,并将其转化到大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达目的蛋白AFP。采用PCR法扩增编码AFP蛋白的cDNA序列片段,并将其克隆到含有His-tag的pET22b原核表达载体上;重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行IPTG诱导表达;对诱导过程中不同浓度的IPTG和不同的温度进行优化;选定最佳的优化条件进行诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE电泳和Western Blot法鉴定表达产物。结果表明,通过PCR扩增技术获得了编码AFP蛋白的基因片段;重组质粒经双酶切和基因测序等方法鉴定后,确认了重组质粒已经构建成功;表达产物通过利用SDS-PAGE和Western Blot法检测到在66 kDa附近出现条带,与预期值相符,表明重组AFP蛋白已成功表达。     

禽蛋黄过敏原Gal d 6的重组表达、纯化鉴定

目的:建立表达蛋黄Gal d 6 重组蛋白工程菌,并鉴定重组Gal d6蛋白免疫活性。方法:直接合成Gal d 6 DNA,与pET-28a构建重组质粒,转化E.coli BL21经IPTG诱导表达;优化表达条件制备重组Gal d 6蛋白,经镍离子亲和层析柱纯化得到纯品蛋白;纯化Gal d6蛋白经间接ELISA及western blot鉴定Gal d 6蛋白免疫活性。结果:经DNA测序、SDS-PAGE、禽蛋过敏血清鉴定表达Gal d 6蛋白具有免疫活性,经镍柱亲和层析获得单一条带。该工程菌最佳表达条件为37 ℃,0.5 mmol/L IPTG,2 h,收获量每升菌液可收获重组蛋白约9.1 mg。重组蛋白与禽蛋过敏血清具有良好反应性。结论:建立稳定表达具有免疫活性的Gal d 6蛋白的工程菌株。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达与优化

从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001中克隆木聚糖酶基因xynⅡ,将不含原酶信号肽编码序列的xynⅡ以正确的读码框克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建成重组质粒pET-Xn并转化大肠杆菌,得到重组工程菌KN21。通过对其进行IPTG浓度、温度等诱导培养条件的优化后,胞内重组木聚糖酶活力最高达到81.77U/mg。对重组木聚糖酶进行酶学性质研究,显示其最适温度为45℃,最适pH为4.5。     

单核细胞增多性李斯特菌p60蛋白表达条件的优化

在成功构建重组表达载体pET-28a-p60 和获得重组宿主菌E.coli BL21(DE3)的基础上,对重组宿主菌E.coliBL21(DE3)进行表达p60 蛋白条件的优化研究。结果表明：将重组大肠杆菌培养至OD600nm 达0.7～0.8 左右时,加入浓度为1mmol/L 的异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),在摇床温度为25℃,转速为150r/min 条件下诱导表达6h,可得到重组表达的p60 蛋白占总蛋白的比例为42.32%,其中可溶性蛋白占总p60 蛋白的比例为85.36% 左右,为p60 蛋白诱导表达的最优条件。     

密码子优化提高海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的表达水平

目的优化灰色链霉菌海藻糖合成酶(Trehalose synthase,TreS)基因密码子,提高海藻糖合成酶大肠杆菌基因工程菌株表达水平。方法基于大肠杆菌基因组密码子偏好数据表对tres基因进行密码子优化得基因tres1。基因工程法构建分别含tres及tres1基因的表达载体pET-26b(+)-tres和pET-26b(+)-tres1,CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)获得表达海藻糖合成酶的大肠杆菌基因工程菌株,采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对摇瓶发酵粗酶液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析及酶活性测定以确定表达水平。结果 1707 bp海藻糖合成酶tres基因共优化碱基序列268 bp,优化后序列的GC含量由65.8%降低至54.4%,密码子适应指数(CAI)由0.37提升至0.97,SDS-PAGE及酶活性分析表明,含pet-26b(+)-tres1表达载体的大肠杆菌基因工程菌株海藻糖合成酶蛋白表达量高,酶活性比含pet-26b(+)-tres工程菌提高60.3%以上。结论密码子优化可有效提高海藻糖合成酶TreS蛋白在大肠杆菌中的表达,为海藻糖合成酶的异源高效表达提供了重要参考。     

噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达

噬夏孢欧文氏菌基因crtE编码GGPP合成酶。通过PCR扩增获得crtE基因,克隆进表达载体,构建表达质粒pET-15bcrtE。重组质粒转化E.coli BL21(DE3),构建工程菌;重组GGPP合成酶在大肠杆菌中实现了高效表达,表达量占菌体总蛋白的42%。重组蛋白以包含体形式存在,包含体经洗涤、尿素溶解、复性并经镍离子亲和层析树脂纯化,得到了电泳纯的重组噬夏孢欧文氏菌GGPP合成酶,带有His-tag的该蛋白分子量为34kDa,pI值为6.3。     

创伤弧菌外膜蛋白VuuA的表达纯化及复性

对创伤弧菌重组外膜蛋白VuuA进行表达纯化及复性,以获得可溶性VuuA蛋白。构建重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-28a-vuuA,利用IPTG诱导表达重组蛋白VuuA,利用亲和层析分离纯化蛋白并对包涵体进行复性。VuuA蛋白主要以包涵体形式存在于重组工程菌细胞内,经复性后和亲和层析纯化后,蛋白浓度达到28.2mg/L发酵液,有效提高可溶性蛋白的浓度。VuuA蛋白的纯化及复性为创伤弧菌新型疫苗的制备奠定了基础。     

不同质粒表达大肠杆菌碱性磷酸酶的研究

目的比较以pET-30a和pET-22b两个质粒表达碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)的活性差异。方法以质粒pET-30a-AP为模板,克隆大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)ATCC 25922的碱性磷酸酶成熟肽基因,并构建重组表达质粒pET-22b-AP。将这2种表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达AP。对温度和甲醇对AP活性的影响进行研究。结果 pET-30a-AP所产AP浓度约为pET-22b-AP 10倍时,才可达到类似催化效果;表达自pET-22b-AP质粒的AP对甲醇的耐受性略好于pET-30a-AP。结论本研究可为AP的生产及基因工程抗体-AP融合蛋白在类似ELISA等免疫检测方法的应用提供重要的参考依据。     

马槟榔甜蛋白基因(MabinlinⅡ)的密码子优化及其在大肠杆菌中的表达

本研究根据大肠杆菌密码子的偏好性,对马槟榔甜蛋白基因MabinlinⅡ(A链+B链)的密码子进行优化,并将优化后的马槟榔甜蛋白基因命名为MabinlinⅡ(AB)Plus。将MabinlinⅡ(AB)Plus基因与大肠杆菌表达载体pET-28a(+)片段连接,构建重组表达载体pET-28a(+)-MabinlinⅡ(AB)Plus,进而转化到大肠杆菌宿主表达菌株BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达。结果表明,密码子优化后的基因MabinlinⅡ(AB)Plus在大肠杆菌中最佳表达条件为:最适IPTG浓度1.4 mmol/L,最佳诱导剂温度为37℃,最适菌株起始生长量OD₆₀₀为0.7,最佳诱导时间8 h。在最佳诱导表达条件下,目的蛋白表达量占菌体总蛋白约33.0%,与优化前约有提高7%。目的蛋白的上清液经过亲和纯化,在19 kDa处有单一的目的条带。经过感官评定,目的蛋白的甜度约为2%标准蔗糖溶液的400倍。这为研发以马槟榔甜蛋白为基础的新型甜味剂提供了科学的理论依据。     

表达金丝桃素合成酶的基因工程菌发酵工艺研究

采用摇瓶发酵试验,分别对影响工程菌生长和表达的条件：培养基初始pH值、诱导温度、诱导时间、诱导物浓度等进行了考察,优化了重组大肠杆菌的发酵条件,确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺,即工程菌在pH值为7．4、温度为25℃、IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖）浓度为0．8mmol／L时蛋白表达量最高。     

外切型琼胶酶AgaO的高效表达及酶学性质表征

根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化外切型琼胶酶AgaO的基因并人工全合成,克隆入表达载体质粒pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件即诱导温度、诱导时间和诱导剂IPTG终浓度,纯化重组蛋白rEAgaO,并分析其酶学性质变化。结果表明,重组酶rEAgaO在16 ℃、IPTG终浓度0.1 mmol/L条件下诱导20 h时表达量最高;95%以上的重组蛋白质为水溶性表达,产量约为1432.7 mg/L,较优化前原始基因的产量提高了10.9倍;重组酶rEAgaO的最适反应温度为45 ℃,在低于40 ℃的温度下预处理2 h后,仍然具有90%以上的残余活性,最适pH为7.0,在pH6.0~10.0不同缓冲体系4 ℃处理2 h仍保留69.5%以上的活性;该酶降解琼脂糖后的最终产物经TLC分析鉴定为新琼二糖。基因密码子优化虽不改变蛋白质氨基酸序列,但可明显提高水溶性重组蛋白质的产率及酶活,对促进相关酶类的生产和应用具有借鉴意义。     

细胞穿膜肽与人表皮生长因子在大肠杆菌中的重组融合表达

该研究构建了细胞穿膜肽Pep-1和人表皮生长因子hEGF融合基因（epEGF）的重组表达质粒PGEX-4T-1-epEGF,并成功转化大肠杆菌BL21（DE3）得到重组大肠杆菌株BL21（DE3）/PGEX-4T1-epEGF。通过IPTG诱导发酵,制备重组融合人表皮生长因子蛋白,并初步尝试建立纯化研究,有效实现了人表皮生长因子（hEGF）在大肠杆菌中的可溶性表达。该研究通过发酵条件优化,发现发酵过程中温度、诱导剂浓度、诱导时间、培养基都是影响蛋白表达量的关键因素;温度在20 ℃、IPTG浓度0.4 mmol/L、诱导时间8 h、培养基为TB液体培养基,目的蛋白占总蛋白的量达到21.58%,蛋白浓度为0.13 mg/mL。菌体破碎液上清经过GST亲和层析融合蛋白纯度达到66.82%,阴离子交换层析后融合蛋白纯度达到92.57%。该研究成功在大肠杆菌中表达出可溶形式的hEGF,且纯化工艺较简单,为hEGF的进一步开发利用提供了参考。     

牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

以实验室保存的携带凝乳酶原前体基因的重组载体pMD 19-T/bPPC为模板克隆凝乳酶原基因,经双酶切后与载体pET-30a连接得到重组载体pET-30a/bPC,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。重组蛋白经变性/复性、DEAE-Sepharose Fast Flow纯化和自催化后检测凝乳活性。结果表明,重组凝乳酶原基因在大肠杆菌中高效表达,表达量占菌体总蛋白的68%,采用Arima K方法检测,其凝乳活力达到80 SU/mL。因此,通过大肠杆菌表达系统大量制备具有生物活性的重组牛凝乳酶原的策略是可行的,研究结果为弥补国内天然牛凝乳酶的短缺提供一种途径。     

重组大肠杆菌E. coli BL21/pET28a(+)-mle产苹果酸乳酸酶发酵条件的优化

该研究以实验室构建的重组大肠杆菌E. coli BL21/pET28a(+)-mle为研究对象,以L-乳酸量为评价指标,通过单因素和正交试 验研究了诱导温度、培养基起始pH值、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）浓度和诱导时间对重组大肠杆菌E. coli BL21/pET28a (+)-mle分泌表达苹果酸乳酸酶（MLE）的影响。 结果表明,重组大肠杆菌E. coli BL21/pET28a(+)-mle分泌表达苹乳酶的最佳培养条件 为培养基起始pH值为5.9,诱导温度为28 ℃,IPTG 浓度0.6 mmol/L,诱导时间3 h。 在此优化条件下,L-乳酸产量为2.37 g/L,较优化前 提高9.48倍。     

分散泛菌胞内脱乙酰酶在大肠杆菌中重组表达条件优化及酶学特性

目的 对分散泛菌的胞内脱乙酰酶(Pantoea dispersa N-acetylglucosamine deacetylase, Pd-nagA)进行表达条件优化及酶学性质分析。方法 本研究使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术对分散泛菌全基因组中Pd-nagA基因序列进行全长扩增，将含有Pd-nagA基因的质粒pET-28a(+)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，同时采用单因素实验，优化诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)的浓度，采用Ni2+-次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid，NTA)进行重组酶的纯化，再对其酶学特性进行测定。结果 以pET-28a(+)质粒作为表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了可溶形式的Pd-nagA蛋白，分子量约为40 kDa。当诱导温度为28℃，诱导前菌液OD600值为1.2，IPTG浓度为0.6 mmol/L，诱导时间为20 h时，Pd-nagA蛋白得到了大量表达。通过薄层层析法分析表明Pd-nagA重组蛋白能够在体外转化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖，Pd-nagA重组蛋白能够在高盐溶液中保持一半的相对酶活性，该酶储存10 d的相对活性仍然保持在90%以上，具有良好的储存稳定性，催化N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)生成氨基葡萄糖(glucosamine, GlcN)反应条件简单快捷。结论 本研究成功异源表达了具有催化活性的Pd-nagA酶，并对表达条件进行优化及酶学特性探究，可为工业上单酶催化制备氨基葡萄糖提供一定的理论参考。