微滴式数字聚合酶链式反应定量检测食品中金黄色葡萄球菌方法的研究

目的 建立微滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)快速定量检测食品中金黄色葡萄球菌的方法.方法 以金黄色葡萄球菌nu基因为靶序列,筛选出同时适用于实时荧光定量PCR(qPCR)和微滴数字PCR(ddPCR)的引物探针,建立食品中金黄色葡萄球菌ddPCR快速定量检测方法,并对该方法进行特异性、灵敏度、准确性和重复性实验.结果...     

液滴数字PCR定量检测鸭血制品中掺假成分

鸭血制品作为市场常见商品,掺假现象十分严重。选取鸡、鸭、鹅基因组中的特异性单拷贝基因为靶基因,设计引物和探针,建立鸡、鸭、鹅血微滴数字PCR定量检测方法。使用人工混合样品对该方法的准确性进行验证,同时通过检测市售样品来验证方法的适用性。实验结果表明,样品含量在1~1000 μg/mg时,靶基因拷贝数与样品质量之间具有良好的线性关系,检测限和定量限分别为5 μg/mg和1 μg/mg。通过人工混合样品和市售样品检测证明,该方法具有良好的准确性和适用性,可用于对鸡、鸭、鹅血制品的定量检测。     

微滴式数字PCR对肉制品中羊肉和猪肉定量分析

为了实现肉制品中羊肉和猪肉的量化研究,本文应用微滴式数字PCR对肉制品进行定量检测。通过在看家基因上设计单拷贝特异性引物,能更好的鉴别是人为因素的掺假还是在加工过程中无意的带入。根据dd PCR的结果显示,在一定范围肉质量和DNA的浓度,DNA浓度和DNA拷贝数(C)成现一定的线性关系。通过人为掺假及市售样品检测以验证此方法。以DNA浓度作为中间换算值,得到肉质量和DNA拷贝数之间的换算关系M_羊=0.12C-10.6 M_猪=0.07C+4。通过对已知掺假比例的肉样及市售样品进行检测,能够较好的得到掺假肉的质量。目前市场上存在一定的掺假现象且该检测方法具有一定市场应用前景,本文建立的微滴式数字PCR在羊肉和猪肉及其制品中的掺假检测具有较强的应用潜力,对目前混乱的肉制品掺假的市场监管提供了科学的依据。     

肉制品中羊源性成分微滴数字PCR法定量检测方法的研究

为准确定量肉及肉制品中羊源性成分的含量,建立了微滴数字PCR定量检测系统。结果显示在一定范围内羊肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,选择DNA含量作为中间换算值,计算出羊肉的质量与拷贝数之间的关系为M_羊=0.03C+0.69。应用建立的微滴数字PCR定量检测方法对已知质量分数的羊肉模拟混合样品进行检测,发现无论在两两混合还是多肉样混合的情况下,其含量偏差最大为1.52%,具有较强的抗干扰能力。通过对市售样品的检测,显示该方法能够准确检测出不同样品中羊肉的含量,并发现可能存在掺假现象,说明该检测方法具有良好的市场应用前景。本实验建立的微滴数字PCR定量方法在肉及肉制品中羊源性成分检测方面具有较大的应用潜力,为肉制品日常检测及是否掺假提供有力的科学依据。      

肉制品中羊源性成分微滴数字PCR法定量检测方法的研究

为准确定量肉及肉制品中羊源性成分的含量,建立了微滴数字PCR定量检测系统。结果显示在一定范围内羊肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,选择DNA含量作为中间换算值,计算出羊肉的质量与拷贝数之间的关系为M_羊=0.03C+0.69。应用建立的微滴数字PCR定量检测方法对已知质量分数的羊肉模拟混合样品进行检测,发现无论在两两混合还是多肉样混合的情况下,其含量偏差最大为1.52%,具有较强的抗干扰能力。通过对市售样品的检测,显示该方法能够准确检测出不同样品中羊肉的含量,并发现可能存在掺假现象,说明该检测方法具有良好的市场应用前景。本实验建立的微滴数字PCR定量方法在肉及肉制品中羊源性成分检测方面具有较大的应用潜力,为肉制品日常检测及是否掺假提供有力的科学依据。     

应用微滴数字PCR技术快速检测食用菌中沙门氏菌

定量风险评估是整个风险评估体系的发展趋势和终极体现形式,而快速、准确、简便的定量技术则是保障整个体系顺利、有效完成的核心支撑。作者根据沙门氏菌inv A毒力基因序列,在前人对引物研究结果基础上,合成特异性引物和探针。以沙门氏菌标准菌株为研究对象,建立沙门氏菌微滴数字PCR的快速定量检测方法,并对其特异性、灵敏度、样品实测等关键指标与传统培养法进行对照验证。结果表明,所建立的微滴数字PCR方法具有较好的特异性,检测灵敏度可达到10~2CFU/m L,样品实测与传统国标法对比,二者符合率100%。所建立的沙门氏菌微滴数字PCR定量检测方法,可以快速、准确、直接地分析沙门氏菌的含量,无需构建质粒和标准曲线,避免了因标准曲线量值偏差而影响样品定值的准确性,所建立的方法为食源性沙门氏菌污染的快速定量检测提供了技术支撑,为微生物风险评估体系的完善奠定了基础。     

猪链球菌微滴数字PCR定量检测方法的建立

根据猪链球菌(Streptococcus suis,SS)gdh基因的保守序列设计特异性引物和Taq Man探针,通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的检测,建立可对其准确定量的微滴数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法进行比较分析。结果表明,该方法特异性良好,与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪圆环病毒2型和伪狂犬病毒无交叉反应;灵敏度优于qPCR,线性相关系数(R2)为0.991,呈良好线性关系,最低可检测到2.692 copies/μL的阳性质粒;稳定性好,变异系数为1.66%。临床样品定量检测结果表明,dd PCR具有敏感性高、特异性好等优点,能对qPCR检测的可疑样品进行精确定量。本研究建立的dd PCR能够准确定量检测SS,将为SS相关研究提供有益参考。     

四种基因定量方法对实时荧光PCR与微滴式数字PCR检测霍乱弧菌基因表达量的分析

基因表达量测定对基因功能解析和探索生命机理具有重大意义,目前实时荧光PCR和微滴式数字PCR技术是进行基因表达量测定的有效方法。本文以低温处理的霍乱弧菌sfs、vcc、Rec A、hly及16S r RNA基因为研究对象,分别用实时荧光PCR和微滴式数字PCR技术对低温处理前后霍乱弧菌的上述基因表达量进行测定,实时荧光PCR实验数据分别采用??CT和ge Norm法进行分析,微滴式数字PCR实验数据分别采用相对定量和绝对定量法进行分析,获得处理组基因表达量相对于对照组的变化倍数;使用多维尺度法来分析四种基因定量方法的数据。结果表明,在本实验条件下,四种基因定量方法的分析结果存在差异;16S r RNA基因表达量发生了变化,不适合作为内参基因;微滴式数字PCR能更直观的给出基因表达量变化的结果,并且基因表达差异相对定量分析的准确度更高。     

基于微滴数字PCR阿胶定量检测方法的建立

为对阿胶及相关产品进行精确定量和纯度鉴定,本研究建立了一种基于微滴数字PCR(ddPCR)的阿胶定量检测方法。结果显示,在一定范围内阿胶质量与DNA含量以及DNA含量与DNA绝对拷贝数间均呈线性关系。以DNA含量作为换算值,确定出阿胶质量M_阿胶(mg)与DNA绝对拷贝数C(copies/μL)的线性关系为M_阿胶=0.13C+3.05。最终利用ddPCR检测样品中目的基因的绝对拷贝数来确定样品中的阿胶含量。准确性验证实验显示实测值与真实值基本保持一致,实测偏差最大仅为4.0%,这表明所建立的方法准确可靠。利用该方法对市场上不同品牌的8个阿胶和2个阿胶速溶粉进行检测,结果显示8个阿胶中,3款阿胶较纯,2款阿胶的阿胶含量较低,最低的仅为23.3%。而2款阿胶速溶粉的阿胶含量分别为44.8%和39.8%。以上表明该方法能有效对市售的阿胶产品进行定量检测和纯度鉴定。本实验建立的基于ddPCR的阿胶定量检测方法准确、高效、稳定,有较大的应用价值和应用前景,可有效预防阿胶掺假现象的发生。     

微滴式数字PCR定量检测杏仁露中杏仁、花生源性成分

为定量分析市售杏仁露中杏仁源性成分和掺假花生源性成分的含量,本研究基于微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）技术建立准确的检测方法。从杏仁、花生的植物组织提取核酸后,建立植物源性成分质量（M）与DNA拷贝数（C）之间的线性关系。ddPCR研究结果显示,在一定范围内杏仁、花生的质量和DNA含量、DNA含量和DNA拷贝数均呈显著的线性关系,以DNA含量为中间值换算得出公式：M杏仁=0.13C＋1.24,M花生=0.081C－0.63。通过已知混合比例的两物种掺假模型验证该公式的准确性和适用性,并对市售的12 个杏仁露样品进行检测。研究表明,该方法准确可靠,能达到精准定量。本研究建立的ddPCR方法可有效甄别杏仁露中的花生源性成分为无意沾染或有意掺杂,在杏仁露中杏仁和花生含量的定量检测方面具有较大应用潜力,为植物蛋白饮料的市场监管提供技术支持。     

红薯源性成分微滴式数字PCR的检测与定量分析

本文根据红薯单拷贝物种基因β-淀粉酶基因(Ipomoea batatas beta-amylase gene,β-AMY)特异性片段设计引物组和探针,建立了红薯成分特异性定量检测的微滴数字PCR检测方法及β-AMY基因拷贝数浓度(copy number/μL)与红薯质量(mg)的线性关系,并对方法的特异性、灵敏度和适应性均进行了测试。结果显示建立的红薯成分数字PCR检测方法特异于红薯成分检测,在20μL反应体系中定量下限(limit of quantitation,LOQ)和检测下限(limit of detection,LOD)分别为2.53 copies/μL和0.67 copies/μL。根据建立的拷贝数浓度(copy number/μL)与红薯质量(mg)的线性关系,对红薯质量百分比为5%和25%的样本进行定量检测,检测结果经换算得到的红薯含量分别为4.15%和21.33%,回收率分别为83.06%和85.31%,RSD值在6.33%～6.95%之间,表明本方法可对质量百分比为5%及以上的红薯成分进行准确定量,在定量检测方面具有较大应用潜力,可为市场监管提供了技术支持。     

微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中金黄色葡萄球菌

基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR)技术,建立发酵乳中金黄色葡萄球菌定量检测方法。以金黄色葡萄球菌nuc基因为目的片段设计特异性的引物和探针,优化反应体系,通过活菌提取和ddPCR方法对靶标基因的检测特异性和灵敏度进行实验,并对定量结果进行分析。本研究建立了发酵乳中ddPCR技术定量检测金黄色葡萄球菌的方法,检测特异性良好,检测灵敏度为3.3×10~1 CFU/g,定量的偏差率为+10.18%,证明了ddPCR用于绝对定量检测的可行性,为其他食品污染菌和致病菌标准化控制体系提供有益的示范作用。     

应用微滴式数字聚合酶链式反应定量检测牛肉制品中的猪源性成分

参照GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光聚合酶链式反应法》,以牛的生长激素（growth hormone,GH）基因和猪的朊蛋白（prion protein,PRNP）基因2 种核基因为靶基因合成特异性引物和探针。理论推导单位质量牛肉的GH基因与猪肉PRNP基因拷贝数之比为一固定值,通过微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）方法对该固定值进行检测和验证,并以该固定值对牛肉/猪肉人工混合样本和市售牛肉制品中的猪肉成分进行定量检测。结果表明：该方法具有良好的准确性及可重复性;牛肉中掺杂猪肉质量分数在5%～99%范围内时,检测结果绝对误差小于1.28%,变异系数小于6.5%,猪肉成分的回收率为99.09%～102.80%;20 份牛肉制品中,4 份检出猪肉成分,其中3 份的相对含量为29.19%～98.15%,1 份为0.12%（低于本方法检出限5%）。因此,ddPCR方法可以较好地应用于牛肉制品中掺杂猪肉成分的定量检测。     

猪胸膜肺炎放线杆菌微滴数字PCR定量检测方法的建立

为实现对猪胸膜肺炎的致病菌猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的量化研究,本实验根据猪胸膜肺炎放线杆菌特异性基因ApxⅣ的保守序列,设计引物探针,通过优化反应条件,建立可对其准确定量的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度、稳定性以及适用性进行验证,与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法进行比较分析。结果表明:ddPCR最佳退火温度为52℃;线性相关系数(R~2)为0.9957,线性关系良好;灵敏度达153.8copies/μL,是qPCR的两倍;特异性良好,与其它常见猪病原无交叉反应。在实际样品检测中,110份样品的ddPCR与qPCR检测结果的Kappa系数为0.9529,说明两种检测方法结果高度一致,并且ddPCR可对qPCR无法判断阴阳性的可疑样本进行定量分析。本实验建立的ddPCR方法敏感性高、特异性强、可用于猪胸膜肺炎放线杆菌的定量检测。     

猪圆环病毒3型微滴数字PCR定量检测方法的建立

猪圆环病毒3型是一种新型猪圆环病毒,可引起猪感染相关疾病。本实验根据猪圆环病毒3型的OPF2基因序列,设计引物探针,建立了可对其准确定量检测的微滴数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)方法。通过对dd PCR反应体系中的引物探针浓度和退火温度进行优化,得到dd PCR反应的最佳引物探针浓度比为800 nM:800 nM:400 nM;最佳退火温度为60℃。该dd PCR方法的标准曲线相关系数(R2)为0.999,呈良好的线性关系;灵敏度高,可达4.4 copies/μL;特异性良好,与常见猪病原无交叉反应。通过对临床样品的检测结果证明,本研究建立的猪圆环病毒3型dd PCR检测方法比实时荧光PCR检测方法的灵敏度高1个数量级,检测结果与荧光PCR定性结果一致,并且可对可疑样本进行定量分析。结果表明:新建立的dd PCR方法灵敏度高、特异性强,可用于猪圆环病毒3型的定量检测。     

微滴式数字PCR定量分析新生儿的肠道菌群

目的:研究表明新生儿出生时已携带大量细菌,而分娩方式是影响其早期肠道菌群建立的重要因素。目前多数研究只分析了不同分娩方式对新生儿肠道菌群结构的影响,而对新生儿肠道菌群的定量研究较少,且没有关于产妇生育年龄与新生儿肠道菌群的关联性研究。方法:采集14份新生儿胎便样品,利用微滴式数字PCR技术对胎便中的细菌总数以及核心菌群的肠杆菌科、乳杆菌属、双歧杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、普氏菌属、链球菌属、乳球菌属、肠球菌属和大肠杆菌进行定量研究。结果:不同分娩方式对新生儿肠道细菌总数存在显著性差异(P0.05),其中自然分娩新生儿肠道中肠杆菌科和乳杆菌属的绝对含量均显著高于剖腹产新生儿(P0.05)。此外,高龄产妇所生新生儿肠道中链球菌属的绝对含量显著高于适龄产妇所生新生儿(P0.05)。结论:产妇的分娩方式和生育年龄可能影响母婴菌群的传递。本研究采用的微滴式数字PCR技术具有高灵敏度,可用于新生儿肠道菌群的定量检测。     

水产品中创伤弧菌ddPCR定量方法的建立

选取创伤弧菌单拷贝基因met为靶基因,设计引物探针,建立对创伤弧菌准确定量的微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)方法,并进行特异性、灵敏度和重复性实验,同时与实时PCR(real-time PCR)方法进行比较。结果显示,所建立的ddPCR方法可以快速、高效地检测出创伤弧菌,细菌纯培养物中其定量限可达323拷贝数/mL,检测限可达61拷贝数/mL,人工污染牡蛎样品中能最低能检测到1.13×102拷贝数/g的目标菌。对人工污染样品中目标菌的检测,ddPCR的定量结果约为平板计数结果的1.4倍,比real-time PCR方法的检测更加稳定准确。本研究建立的ddPCR检测方法能快速准确、特异、灵敏地定量检测创伤弧菌。